姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。     

系统性红斑狼疮患者外周血BMP/Smads信号通路相关基因表达及与OPG/RANKL的相关性分析

目的:研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血BMP/Smads信号通路相关基因表达,了解其与OPG/RANKL相关性,探讨其在SLE骨代谢中的意义?方法:选取SLE患者26例及正常对照组20例,运用实时定量PCR方法检测两组外周血单个核细胞BMP/Smads信号通路相关基因BMP-2?Smad1?Smad5?Smad8及RANKL?OPG的表达,ELISA法定量检测血清中RANKL?OPG水平,计算OPG/RANKL比值;分析Smad1?Smad5?Smad8基因表达量与疾病活动相关指标及OPG/RANKL相关性?结果:SLE患者外周血单个核细胞OPG/RANKL系统中OPG基因mRNA表达水平较正常对照组减低 (0.002 5 ± 0.000 7 vs. 0.017 6 ± 0.006 7,P < 0.05),RANKL基因mRNA表达水平无统计学差异 (0.003 3 ± 0.001 0 vs. 0.002 4 ± 0.000 9,P > 0.05),SLE患者OPG/RANKL比值较正常对照组明显减低 (0.229 6 ± 0.071 2 vs. 0.609 5 ± 0.165 1,P < 0.01)?SLE患者Smad1?Smad8基因mRNA表达水平较正常对照组明显减低 (0.003 1 ± 0.000 4 vs. 0.006 6 ± 0.000 7;0.003 3 ± 0.000 5 vs. 0.005 6 ± 0.000 6,P < 0.01),Smad5基因mRNA表达较正常对照组减低(0.001 7 ± 0.000 3 vs. 0.004 2 ± 0.000 4,P < 0.05),SLE患者与正常对照组BMP-2基因mRNA表达水平无统计学差异(0.006 9 ± 0.002 0 vs. 0.010 5 ± 0.002 1,P > 0.05)?SLE患者组血清RANKL表达较正常对照组明显增高(P < 0.01),OPG表达在两者间无明显统计学意义(P > 0.05),SLE血清OPG/RANKL较正常对照组明显减低(P=0.006)?相关性分析显示,SLE患者Smad8 mRNA水平?OPG/RANKL均与血沉呈正相关 (P < 0.05)?OPG mRNA水平与Smad8 mRNA表达水平呈正相关P <0.01,而RANKL与Smad1 mRNA基因表达呈负相关(P < 0.01)?结论:SLE患者体内BMP/Smads系统基因表达存在异常,可能与SLE的骨代谢异常相关?     

骨形态发生蛋白-7对胚胎小鼠髓核细胞成骨分化和Notch信号表达的影响

目的：探索骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）诱导胚胎小鼠椎间盘髓核细胞（nucleus pulposus,NP）的成骨分化及对经典Notch信号通路的调控作用。方法：重组腺病毒BMP-7（recombinant adenovirus-mediated bone mor－phogenetic protein-7,Ad-BMP-7）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,Ad-GFP）在HEK293细胞中扩增,感染NP细胞。实验分为BMP-7组（n=3）、GFP组（n=3）、空白组（n=3）。RT-PCR检测BMP-7的mRNA水平表达;Real-time PCR检测成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）以及经典Notch信号通路分子的mRNA表达水平;Western blot检测成骨转录因子Runx2和OPN的蛋白表达水平;采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）读数和ALP染色检测ALP活性。结果：Ad-BMP-7和Ad-GFP在HEK293细胞中高滴度的扩增。NP细胞中BMP-7的基础表达很低,Ad-BMP-7感染NP细胞可高表达BMP-7,并明显提高OPN、OPG的mRNA水平表达（OPN：BMP-7组21.16±0.45,GFP组1.00±0.07,空白组2.84±1.27,F=613.815,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000;OPG：BMP-7组2.05±0.37,GFP组1.00±0.06,空白组1.22±0.36,F=10.046,P=0.012,BMP-7组与GFP组比较P=0.016,与空白组比较P=0.047）,成骨转录因子Runx2及OPN的蛋白表达水平也均高于对照组,特异性成骨指标ALP的活性明显增强,ALP染色呈紫蓝色,明显高于对照组（BMP-7组222 676.8±7 643.2,GFP组31 455.5±4 930.6,空白组42 407.3±10 926.8,F=513.417,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000）。Ad-BMP-7感染3 d可促进Notch信号通路Notch-1、Notch-2、Jag-1、Hey-1的mRNA水平表达增高（Notch-1：BMP-7组5.90±0.66,GFP组2.83±0.32,空白组1.00±0.05,F=94.574,P=0.002,BMP-7组与GFP组比较P=0.003,与空白组比较P=0.004;Notch-2：BMP-7组150.35±11.78,GFP组1.94±0.46,空白组1.01±0.19,F=318.962,P=0.001,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000;Jag-1：BMP-7组7.97±0.00,GFP组2.22±0.71,空白组1.00±0.00,F=166.476,P=0.001,BMP-7组与GFP、空白组比较均P=0.000;Hey-1：BMP-7组11.23±0.4,GFP组0.42±0.04,空白组1.00±0.10,F=1 082.054,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000）,但第7天回复到基础表达水平,其余信号分子表达无明显差异。结论：腺病毒介导的BMP-7可诱导NP细胞成骨分化,可能与Notch信号通路部分分子的一过性上调相关。     

Wnt3a协同BMP9调控间充质干细胞成骨分化及机制研究

目的：探讨经典Wnt信号通路与骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（Mes－enchymal stem cells,MSCs）成骨的相互影响及分子机制。方法：以小鼠骨髓来源MSCs C3H10T1/2为目的细胞,用Wnt3a上调经典Wnt信号通路,联合BMP9作用于细胞,通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性测定、钙盐沉积实验、real time PCR、免疫细胞化学染色等方法观测BMP9与经典Wnt信号通路联合后对MSCs成骨分化的影响。结果：Wnt3a明显促进了BMP9诱导的ALP活性的增加[F=264.962,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=7.19,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=16.36,P=0.000],同时也明显增加了成骨标志物骨钙蛋白（Osteocalcin,OC）[F=3 920.102,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=39.10,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=62.56,P=0.000]和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）[F=1 935.824,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=40.88,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=56.42,P=0.000]的表达以及Runx2的mR－NA的表达[F=3 635.980,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=79.37,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=86.96,P=0.000],并且还促进了钙盐沉积。结论：Wnt3a与BMP9相互协同诱导MSCs的骨向分化,其中成骨转录因子Runx2可能作为二者的交汇点起了重要作用。     

Notch信号通路在骨形态发生蛋白9诱导的多潜能干细胞成骨分化中的作用

目的 初步探讨Notch信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导多潜能干细胞成骨分化的作用和机制.方法 腺病毒表达载体(AdBMP9/AdGFP、AdHey1/AdRFP)和BMP9/GFP条件培养基处理C2C12细胞,细胞化学染色和活性定量检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP),定量RT-PCR检测Notch信号通路靶基因Hey1,以了解Hey1在AdBMP9介导的成骨分化作用中的表达和作用;采用细胞密度实验和Notch信号通路抑制剂(DAPT)检测Notch信号通路对成骨的影响;在AdBMP9/AdGFP处理下,检测细胞上Notch信号通路配体、受体表达变化.结果 AdBMP9作用下,1、3、5、7 d ALP活性持续增加(P<0.05);Hey1一过性升高,其与AdBMP9呈剂量依赖性;Hey1可协助BMP9成骨(P<0.05),不能单独起效.80%和40%细胞密度组ALP量和Hey1表达均高于20%组(P<0.05);DAPT组中ALP活性明显降低(P<0.05);在AdBMP9作用下,Notch信号通路配受体有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最为明显(分别为11.3倍和5.1倍).结论 Notch信号通路参与BMP9介导的多潜能干细胞成骨分化,其可能的机制是BMP9通过诱导Notch通路配体、受体表达上调使Hey1升高,后者协同成骨.     

Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。     

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的：探讨尼古丁（nicotine,NIC）诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法：PC-9分成4组：空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果：尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10 μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05 μmol/L最明显（P=0.000）。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[（15.70±1.53）个/高倍视野 vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin mRNA 表达水平明显降低[（0.932±0.100） vs. （0.459±0.024）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],Vimentin mRNA表达水平明显升高[（1.200±0.200） vs. （1.973±0.129）,F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁＋二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μmol/L时有统计学意义。尼古丁＋二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[（17.00±2.00）个/高倍视野vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁＋二甲双胍组上调E-cadherin mRNA[（0.459±0.024） vs. （0.838±0.058）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],下调Vimentin mRNA[（1.973±0.129） vs. （1.467±0.115）,F=20.998,P=0.000,P=0.003）]。结论：尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。     

姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。     

莱菔硫烷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响

目的：研究莱菔硫烷（sulforaphane,ＳＦＮ）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法：利用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,于MCAO后1 h腹腔注射ＳＦＮ 5 mg/kg。缺血2 h,再灌注24 h时,检测大鼠神经功能缺损评分并用TTC染色测定脑梗死体积;通过检测脑组织髓过氧物酶的含量反映中性粒细胞浸润和炎症反应的程度;Western blot检测核因子－κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）以及白介素－６（interleukin-6,IL-6）的表达变化。结果：与模型组相比,5 mg/kg ＳＦＮ治疗组均能改善大鼠缺血再灌注损伤后神经功能缺损[（2.49±0.48）分 vs. （1.34±0.62）分,P=0.000] 、减少脑梗死体积[（0.41±0.02）% vs. （0.26±0.03）%,P=0.000],降低髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的含量[（0.43±0.02） Ｕ/g vs. （0.35±0.02） U/g,P=0.000]。Western blot的结果显示,ＳＦＮ组脑组织NF-κB、TNF-α以及IL-6蛋白表达与MCAO组比较表达明显降低,分别为（0.39±0.05） vs. （1.65±0.05）,P=0.000;（0.30±0.05） vs. （0.91±0.03）,P=0.000;（0.49±0.11） vs. （1.50±0.03）,P=0.000。结论：ＳＦＮ可以通过减轻炎症反应对大鼠脑缺血/再灌注损伤起神经保护作用,其相关机制可能与其降低 NF-κB、TNF-α以及 IL-6表达有关。