高磷对血管平滑肌细胞骨钙素mRNA表达和钙沉积的影响

目的 观察高磷对培养的牛主动脉平滑肌细胞骨钙素(OC)mRNA表达和钙沉积的影响,探讨高磷是否为促进血管钙化的独立因素。方法 用不同磷浓度[正常组(Pi 1.5 mmol/L)、高磷组(2.0 mmol/L)]的培养液,培养牛主动脉平滑肌细胞,观察72 h骨钙素的表达,以及不同时间(第3、6、9天)血管平滑肌细胞的钙沉积。上清液中骨钙素浓度用放射免疫法测定。RT-PCR观察骨钙素mRNA的表达。平滑肌细胞钙含量用甲O-酚酞络合酮方法测定。BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化骨钙素浓度和钙含量。结果 3d后与正常磷组相比,高磷组上清液骨钙素水平明显增高[高磷组(15.03±2.60)pg/μg蛋白比正常磷组(2.98±0.84)pg/μg蛋白,P<0.001];高磷组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也显著增加(OC/GAPDH:1.91±0.13比0.75±0.04,P<0.001)。高磷组钙沉积显著增加[培养第6天,高磷组(77.19±11.69)μg/mg蛋白比正常磷组(25.77±1.75)μg/mg蛋白,P<0.01],呈时间和剂量依赖性。von Kossa钙染色,高磷组平滑肌细胞中见大量的黑色颗粒沉积。结论 高磷可直接刺激平滑肌细胞的钙沉积和骨钙素产生增加,促进血管平滑肌细胞钙化。高磷血症是促发血管钙化的独立因素。     

血管内皮细胞对体外培养成骨细胞生物学特性的影响

目的通过血管内皮细胞与成骨细胞体外协同培养，探讨血管内皮细胞对成骨细胞生物学特性的影响。方法用12周自愿中止妊娠并捐赠的健康胚胎来源的成骨细胞和血管内皮细胞采取直接和间接协同培养的方法。倒置相差显微镜下观察细胞一般形态，细胞计数比较增殖能力，检测骨钙素和碱性磷酸酶(ALP)活性，研究成骨细胞成骨能力的改变。结果血管内皮细胞与成骨细胞体外协同培养具有良好的细胞相容性，协同培养使细胞增殖加快（P<0.05）。直接、间接协同培养ALP活性分别为（8.200±0.755）μmol/(min*106细胞)，(12.300±1.300)μmol/(min*106细胞)，较成骨细胞ALP活性(4.900±0.800)μmol/(min*106细胞)明显增高（P<0.05）。直接、间接协同培养骨钙素合成量分别为(3.8267±0.4077)μg/L、(5.1533±0.5965)μg/L，较成骨细胞(2.5083±0.5530)μg/L明显增高（P<0.05）。结论体外协同培养血管内皮细胞与成骨细胞，对成骨细胞的生物学特性具有良好的调控作用。     

bFGF和TGF-β1对原代培养的前列腺间质细胞的作用

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)在良性前列腺增生(BPH)中的作用。方法:培养了人BPH间质细胞,采用MTT法检测无血清培养的间质细胞的增殖,用免疫组化方法检测平滑肌细胞表型变化,观察不同浓度bFGF和TGF-β1对培养的人BPH间质细胞的影响。结果:bFGF促进间质细胞增殖(P<0.05、P<0.01),较高浓度时(10μg/L)降低平滑肌细胞表型表达;TGF-β1(>0.1μg/L)抑制间质细胞增殖并增加平滑肌细胞表型表达(P<0.05、P<0.01);5μg/L的bFGF与0.001μg/L和0.01μg/L TGF-β1作用间质细胞,促进细胞增殖(P<0.01),与0.1μg/L,1μg/L及10μg/L TGF-β1作用间质细胞,抑制细胞增殖,0.1μg/L时对细胞的抑制作用轻微(P>0.05),1μg/L及10μg/L时出现明显的抑制(P<0.01),同时TGF-β1在较高浓度时(>1μg/L),平滑肌细胞表型表达明显增加(P<0.01)。结论:bFGF以时间和浓度依赖的方式促进培养的增生前列腺间质细胞的增殖,并减少平滑肌细胞表型表达;TGF-β1抑制间质细胞的生长并诱导间质细胞向平滑肌细胞分化,两者共同在BPH的形成机制中发挥着重要作用。     

肿瘤坏死因子α介导人脐动脉血管平滑肌细胞成骨样钙化

目的 观察肿瘤坏死因子α（TNF-α）对体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞（hUASMC）骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP-2）等成骨样分化标志蛋白表达以及细胞外钙盐沉积的影响。 方法 植块贴壁法原代培养人hUASMC。予以TNF-α刺激，甲O-酚酞络合酮方法测定细胞外基质钙盐沉积；Von Kossa法观察钙化染色；实时定量PCR法测定血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平；免疫印迹法观察血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平。 结果 一定浓度范围内的TNF-α可促进hUASMC增殖；增加细胞外基质钙盐沉积。TNF-α 50 μg/L刺激可在第3天上调血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平（BAP mRNA：1.908±0.034比1.000±0.033，OPN mRNA： 3.600±0.073比1.000±0.079，均P < 0.05）。TNF-α 50 μg/L刺激可在第5天上调血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平（BAP蛋白：3.394±0.083比1.000±0.030，OPN蛋白： 1.967±0.134比1.000±0.070，BMP-2蛋白：2.745±0.289比1.000±0.208， 均P < 0.05）。 结论 一定浓度范围的TNF-α可刺激hUASMC增殖；介导细胞成骨样分化；增加细胞外基质钙盐沉积，从而参与血管钙化的发生发展。     

OPG对高磷诱导的牛血管平滑肌细胞钙化的作用

目的：研究护骨素（OPG）对高磷诱导的牛血管平滑肌细胞钙化是否具有抑制作用。方法：用含不同磷（Pi）浓度（1.4～2.0mmol/L）的培养基体外培养牛血管平滑肌细胞,观察细胞钙沉积及OPG的表达;在高磷（2.0mmol/L）培养基中加入不同浓度外源性OPG测定细胞钙化值的变化。用甲ó-酚肽络合酮法测定钙化量,BCA法（二喹啉甲酸检测法）测蛋白含量,并以细胞蛋白含量标化钙化量。Western Blotting法测定OPG蛋白表达。结果：（1）培养基磷浓度1.4mmol/L组细胞仅有少量钙沉积,随着培养基磷浓度增高及培养时间的延长,细胞钙沉积增加,第9天时,iP2.0mmol/L组与iP1.4mmol/L组钙沉积[（138.00±12.53）μg/mg protein比（22.67±2.52）μg/mg protein]差异有统计学意义。（2）随着培养基磷浓度增高OPG蛋白表达量相应增加。（3）随着培养基中OPG浓度的增高细胞钙化有减少趋势,OPG浓度50ng/ml和100ng/ml组钙化分别为（82.67±5.79）μg/mg protein、（60.67±7.36）μg/mg protein,与单纯高磷组比较其差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：高磷培养基能诱导血管平滑肌发生钙化和OPG表达,且与磷浓度和作用时间有关,外源性OPG能抑制高磷诱导的细胞钙化的产生,而且这种抑制作用具剂量依赖性。     

转化生长因子—β1对前列腺基质细胞基因表达的调节作用

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对前列腺基质细胞基因表达的调节作用.方法原代培养人前列腺基质细胞,并传代至4～6代.分别将浓度为0.01、0.10、1.00、10.00μg/L的TGF-β1加入细胞培养液中.孵育48h后收集细胞.用内参照半定量RT-PCR方法检测前列腺基质细胞雄激素受体(AR)、TGF-β1、bFGF和平滑肌特异性标记蛋白smoothelin基因的转录水平.结果与对照组相比,低浓度(0.01μg/L)的TGF-β1可增强体外培养的前列腺基质细胞内AR表达(P<0.01),差别有显著性意义.随TGF-β1浓度增加,促AR表达作用减弱.随TGF-β1浓度增加基质细胞TGF-β1、bFGF和smoothelin基因的转录增加(P<0.01),并且随着应用浓度增加促各基因转录的作用增强.结论TGF-β1对前列腺基质细胞基因表达具有广泛的调节作用,在前列腺增生发病中具有重要作用.     

双氢青蒿素对前列腺癌细胞PC-3M生长的影响及其机制探讨

目的:观察双氢青蒿素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M细胞凋亡和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度(0、25、50、100μmol/L)的双氢青蒿素分别作用于PC-3M细胞48 h,MTT法检测细胞生长活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率;分光光度法检测细胞凋亡过程中caspase-3、caspase-8活性变化;半定量RT-PCR法检测PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达;Western印迹法检测细胞VEGF蛋白表达。结果:双氢青蒿素能显著抑制PC-3M细胞的增殖,与对照组(0μmol/L)的细胞凋亡率(2.92±0.45)%相比,各剂量组(25、50、100μmol/L)的细胞凋亡率[(8.85±0.74)%,(12.83±0.84)%,(18.65±1.24)%]显著增加,caspase-8[(0.47±0.05)U/μg vs(1.22±0.15)U/μg,(1.76±0.07)U/μg,(2.91±0.24)U/μg]、caspase-3[(0.44±0.07)U/μg vs(0.95±0.08)U/μg,(1.48±0.14)U/μg,(2.92±0.45)U/μg]活性显著增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达和蛋白表达呈剂量依赖性降低。结论:双氢青蒿素能显著抑制体外PC-3M细胞的生长,并促进其凋亡,机制可能与增加凋亡蛋白酶和抑制VEGF表达有关。     

转移生长因子β1对体外培养破骨细胞功能影响的实验研究

目的探讨转移生长因子β1(TGF-β1)对体外培养破骨细胞功能影响的机制.方法酶动力学法测定培养基中酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性;共聚焦激光扫描显微镜观察体外培养破骨细胞内氢离子随TGF-β1浓度的变化情况;Leica Quantimet 500图像分析系统对骨吸收陷窝进行图像分析;扫描电镜观察骨吸收陷窝变化.结果随着TGF-β1浓度的升高,处理组与对照组ACP和TRAP的活性分别从(1.71±0.33U)/L和(1.41±0.29)U/L降低到(1.32±0.21)U/L和(1.01±0.11)U/L(均为P＜0.01),骨吸收陷窝的数目与面积从(16.67±1.35)个/片和(582.24±178.68)μm2减少到(13.29±1.47)个/片与(442.38±148.27)μm2,处理组与对照组比较差异具有显著性(P＜0.01).破骨细胞相对荧光值无显著性差异,表明TGF-β1对体外培养破骨细胞分泌H+无明显影响.结论TGF-β1虽然不能抑制氢离子释放,但能通过改变酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性,进而直接抑制体外培养破骨细胞的骨吸收功能.     

青藤碱对肾小管上皮细胞转分化相关基因表达的影响

目的:探讨青藤碱干预炎症介质诱导的肾小管上皮细胞转分化及其相关基因的表达作用.方法:IL-1β(10 ng/ml)诱导体外培养的小鼠肾小管上皮细胞株(MCT),同时用青藤碱(10 μmol/L、100μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)进行干预.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)和纤连蛋白(Fn)的基因表达.结果:结果:IL-1β能够显著诱导肾小管上皮细胞α-SMA的基因表达上调,同时伴随着TGF β和Fn的基因表达显著上调;而青藤碱各个浓度均具有显著抑制肾小管上皮细胞转分化作用,TGF-β和Fn的基因表达也随之下调.结论:青藤碱可显著抑制IL-1β刺激下的肾小管上皮细胞转分化标志物和细胞外基质的基因表达,其机制可能与部分下调TGF-β的表达有关.     

碱性成纤维细胞生长因子对犬隐静脉间质细胞体外培养抗钙化作用

目的观察作为组织工程瓣间质种子细胞的犬隐静脉间质细胞体外培养钙化机制,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对犬隐静脉间质细胞体外培养钙化的抑制作用。方法分离培养犬隐静脉间质细胞,分为正常培养对照、促钙化培养和bFGF培养3组。2周后行von kossa染色,检测细胞层钙沉积、碱性磷酸酶(ALP)活性及上清液中骨钙素(OC)含量,细胞ALP、OC mR- NA表达。结果培养2周后,促钙化组及对照组均有细胞结节形成,bFGF组细胞呈极性密集生长,无结节形成。von kossa染色促钙化组呈强阳性,bFGF组及对照组呈弱阳性。促钙化组钙沉积及ALP活性比对照组均明显增高(5．384±0．443比2．198±0.173,P＜0.01),ALP高2．13倍(9．611±0．639比4.819±0．334,P＜0．01),bFGF使两者均显著降低(0．192±0．024比5．384±0.443,P＜0．01,3．069±0．178比9．611±0．639,P＜0．01)。促钙化组上清液OC含量于第6天始升高,至第12天到达高峰,然后有轻度下降。bFGF组及对照组均维持较低水平。结论体外培养的犬隐静脉间质细胞在促钙化条件下具有成骨细胞的表型,有明显的钙化现象发生,bFGF具有抑制其钙化的作用。     

重组人核心蛋白多糖固相拮抗转化生长因子β1对瘢痕成纤维细胞的刺激作用

目的模拟人体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1(TGF-β1)接触方式,观察核心蛋白多糖固相拮抗TGF-β1刺激瘢痕成纤维细胞的效果.方法制备成纤维细胞胶原网格(FPCL)体外三维培养模型,将其分为4组.对照组向FPCL中加入培养液;核心蛋白多糖组向FPCL中混入终浓度2 mg/L的重组人核心蛋白多糖,再加入培养液;TGF-β1组向FPCL中加入含5 μg/L TGF-β1的培养液;TGF-β1+核心蛋白多糖组向FPCL中混入终浓度2 mg/L的重组人核心蛋白多糖,然后加入含5μg/L TGF-β1的培养液.在培养12、24、48、72、96 h时观察各组FPCL的收缩情况,并用蛋白质印迹法与逆转录聚合酶链反应分别检测FPCL中瘢痕成纤维细胞Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白及mRNA表达水平.结果各培养时相点下,TGF-β1组FPCL收缩比对照组明显增强,核心蛋白多糖组FPCL收缩则比对照组明显减弱.TGF-β1组的PAI-1、α-SMA的蛋白及相应mRNA表达水平(3 482±211、4 320±272;0.89±0.15、0.56±0.11)显著高于对照组(1 764±147、1 699±146;0.29±0.06、0.21±0.06,P＜0.01);其余两组相应检测指标与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论重组人核心蛋白多糖混入胶原凝胶,可显著抑制TGF-β1对瘢痕成纤维细胞的刺激作用,表明在体外核心蛋白多糖具有拮抗TGF-β1的作用.提示皮肤组织损伤后,由于创面机械性缺少核心蛋白多糖,TGF-β1活性上调,可能是瘢痕增生的一个重要因素.     

孕激素调节人成骨细胞转化生长因子-β1、β2的表达

目的研究孕激素对正常成人成骨细胞转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β2表达的调节作用,探讨孕激素治疗绝经后骨质疏松症(OP)的作用机制.方法鉴定成人成骨细胞(hOB),测定碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素分泌,Van Gieson氏苦味酸酸性复红染色法进行Ⅰ型胶原染色.hOB用孕酮干预.Northern杂交、ELISA分别检测hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA和蛋白质分泌.结果观察到hOB分泌的ALP活性为(74.3±4.7)mU/mg蛋白,培养上清液骨钙素含量为(3.84±0.39)ng/ml蛋白,Ⅰ型胶原染色呈红色.观察到孕酮增强hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达,呈时间依从性.孕酮促进hOB TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌,呈时间依从性.结论孕激素可能通过诱导成骨细胞TGF-β1、TGF-β2表达,促进成骨细胞增殖与分化,增强成骨功能及骨基质合成,促进骨形成.     

TGF-β_1调控ERK/MAPK信号通路对人牙髓细胞增殖和分化能力的影响研究

目的:研究TGF-β_1对牙髓细胞增殖、分化和ERK/MAPK信号通路的影响。方法:采用Western blot检测TGF-β_1在急性牙髓组织、慢性牙髓组织和正常牙髓组织中的表达,然后采用Ⅰ型胶原酶消化分离培养牙髓细胞,不同浓度的TGF-β_1处理牙髓细胞7d,CCK-8法检测细胞增殖。采用TGF-β_1(5.0μg/L)和U0126(10μmol/L)分别单独或联合作用于牙髓细胞7d,CKK-8法检测细胞增殖;在第1、3、5和7天检测碱性磷酸化酶活性;第7天时Western blot检测ERK/MAPK信号通路中的关键蛋白PPAR-γ和ELK-1水平。结果:TGF-β_1在牙髓炎组织中低表达,且TGF-β_1浓度在0.1～5.0μg/L时,从作用第3天开始能够显著促进牙髓细胞的增殖(P0.05),具有时间和剂量依赖效应。U0126能够抑制牙髓细胞的增殖和碱性磷酸化酶的活性,具有时间依赖性。TGF-β_1能够促进PPAR-γ和ELK-1蛋白的表达,而U0126能够降低TGF-β_1对PPAR-γ和ELK-1蛋白表达的促进作用。结论:TGF-β_1可以促进牙髓细胞的增殖和分化,且具有时间和浓度依赖效应,其作用机制可能与ERK/MAPK信号通路相关。     

转化生长因子-β1对乳腺癌细胞株增殖和T淋巴细胞免疫的影响

目的检测转化生长因子(TGF)-β1对乳腺癌细胞株增殖能力和T淋巴细胞免疫的影响,探讨TGF-β1在乳腺癌演进过程中的作用。方法噻唑蓝(MTT)比色法检测TGFβ1对乳腺癌细胞株MCF7、MDAMB157、SKBR3和MDAMB453增殖的影响,探求其调控细胞生长的浓度效应和时间效应。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TGFβ1作用于体外培养的外周血单个核细胞(PBMC)前后白细胞介素(IL)2和干扰素(IFN)γ的分泌。结果作用72h内TGFβ1对乳腺癌细胞有增殖抑制作用(P<0.05),不同的浓度(1.0～100.0)μg/L产生的效果不同。96h后效应减弱至消失。在TGF-β1作用下,PBMC培养上清中IL2(296.5±79.4)ng/L和IFNγ水平(665.3±107.0)ng/L明显低于无TGFβ1作用组(644.9±105.5)ng/L和(922.3±184.1)ng/L,(P<0.01)。结论TGFβ1对乳腺癌细胞的增殖有短暂抑制作用,在一定浓度范围内呈剂量依赖性,作用时间有限。TGF-β1能降低T细胞的细胞因子释放,抑制细胞免疫。     

高糖通过转化生长因子β1-Smad信号传递途径诱导肾小管上皮细胞转分化

目的 通过观察高糖对肾小管上皮细胞转分化(EMT)的作用，探讨其与转化生长因子β1 (TGF-β1)的关系及糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株HKC细胞和高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株为研究对象。蛋白印迹法检测高糖(葡萄糖浓度分别为25和50 mmol/L)对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白 (E-cadherin)和纤连蛋白(FN)表达的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测TGF-β1的水平。Boyden小室检测HKC细胞的迁移能力。抗TGF-β1抗体中和实验分析高糖对肾小管EMT作用及与TGF-β1的关系。 结果 持续的高糖作用(96 h)能够导致HKC表达α-SMA蛋白，其中25和50 mmol/L的葡萄糖分别增加表达α-SMA 2.8倍和8.2倍；降低E-cadherin的表达；刺激合成FN。25和50 mmol/L的葡萄糖刺激HKC 12 h后，细胞培养上清液中TGF-β1浓度分别为(408.5±198.6)和(939.3±311.8) ng/L，呈剂量依赖性。抗TGF-β1抗体能够显著抑制高糖导致的HKC高表达α-SMA蛋白和FN及降低E-cadherin表达的作用。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖的持续作用下，不能表达α-SMA和FN蛋白，E-cadherin也未见降低。细胞迁移实验表明，25和50 mmol/L高糖能够增加HKC迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[(12.4±3.7)和（18.6±4.4)细胞/HP）]，与正常对照组[(3.0±0.8)细胞/HP]差异有统计学意义(P < 0.01)。抗TGF-β1多克隆抗体能够部分抑制高糖(50 mmol/L)造成的HKC细胞向Boyden小室膜下侧面的迁移[(11.9±5.2)细胞/HP]。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖培养条件下迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[（4.3±1.2）细胞/HP]与正常对照组差异无统计学意义。 结论 高糖能够诱导肾小管EMT，此作用与高糖刺激该细胞合成TGF-β1有关，阻止Smad信号途径能够拮抗TGF-β1介导的肾小管EMT的作用。     

血管紧张素Ⅱ对转化生长因子β诱导的人皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对人皮肤成纤维细胞增殖及对转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)诱导的成纤维细胞增殖作用的影响,并初步探讨可能的信号机制. 方法 取自愿捐献的正常皮肤组织标本,采用胶原酶法行成纤维细胞培养.取第4～5代细胞,按实验设计分别加入不同浓度的Ang Ⅱ(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol/L)、 TGF-β(0.1、1.0、10.0 ng/ml)、1×10-10 mol/L Ang Ⅱ+ 0.1 ng/ml TGF-β共8组;对照组仅加入等量DMEM.以3H-TdR掺入法测定细胞增殖,Western blot法检测抗细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)活性变化,观察不同浓度的Ang Ⅱ或/和TGF-β对培养的成纤维细胞3H-TdR掺入量和ERK磷酸化的影响. 结果 与对照组比较Ang Ⅱ(1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol/L)或TGF-β(1.0、10.0 ng/ml)均能促进成纤维细胞的3H-TdR掺入量(P＜0.05);1×10-10 mol/L Ang Ⅱ或0.1 ng/ml TGF-β单独使用不影响成纤维细胞的3H-TdR掺入量,但二者联合使用提高了成纤维细胞的3H-TdR掺入量(P＜0.05).1×10-7 mol/L Ang Ⅱ、10.0 ng/ml TGF-β增加皮肤成纤维细胞的ERK磷酸化,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).1×10-10 mol/L Ang Ⅱ或0.1 ng/ml TGF-β单独刺激成纤维细胞并未影响ERK磷酸化,而二者联合使用增加ERK磷酸化,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).应用抗ERK抗体显示各组ERK含量一致. 结论 Ang Ⅱ不仅能作为促有丝分裂素直接促进成纤维细胞分裂增殖,同时也可作为调节因子促进TGF-β的促增殖作用.Ang Ⅱ和TGF-β通过各自特异性受体共同作用于ERK,使磷酸化增加是其产生协同作用可能的机制之一.     

糖尿病大鼠血管钙含量和骨密度变化的实验研究

目的 观察糖尿病（diabetes mellitus,DM)大鼠模型血管钙含量和骨密度的变化。方法 用大剂量链脲佐菌素 (streptozotocin, STZ)—次性腹腔注射和高脂高糖饲料喂养加小剂量STZ注射制备1型和2型糖尿病大鼠模型,观察对血管钙含量和骨密度（bone mineral density ,BMD)的影响。雄性Wistar大鼠共32只随机分为4组（每组8只）,即对照组、高脂组、1 型糖尿病组和2型糖尿病组。12周后,进行主动脉钙含量、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP)活性和骨钙素（osteocalcin, OC)含量测定;用骨密度仪测定大鼠股骨和腰椎骨密度。结果 1型糖尿病组大鼠血管钙含量（71. 67± 10. 61μmol/mg. dw) 高于对照组和高脂组（44 ± 15. 87和44.8 ±9.44μmol/mg. dw) (P <0. 05);2型糖尿病组大鼠血管钙含量（63. 67 ± 14.32μmol/mg.dw)亦高于对照组和高脂组,但无统计学差异;反映血管钙化程度的指标ALP活性在1型和2型糖尿病组（89. 46 ± 17.8 和 63.68 ±17. 83 U/mg. pr)亦明显高于对照组和高脂组（31. 22 ± 19. 42 和 31. 62 ± 15. 96 U/mg. pr) (P <0. 01 ,P <0. 05); 1 型糖尿病组大鼠的股骨骨密度较其他 3 组均降低（0. 1898 ±0. 0263 vs 0. 224 ±0. 005,0. 2374 ±0. 0113,2431 ±0. 0115 g/cm2) (P<0.01)。结论 糖尿病大鼠主动脉钙含量和骨密度均有变化,提示糖尿病可引起体内钙磷代谢异常,其机制有待进一步探讨。     

三种生长因子对人胚半月板细胞增殖及细胞表型的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1,IGF-1）单独或联合作用于人胚半月板细胞,探讨半月板组织工程种子细胞大量扩增最佳作用组合及浓度。方法无菌条件下取健康妇女意外流产并自愿捐献的4个月人胚半月板,体外分离、培养半月板纤维软骨细胞,用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Aggrecan免疫荧光染色检测其性状。取第3代细胞贴壁后使用血清饥饿法同步化细胞,加入IGF-1（1、10、50、100μg/L）、TGF-β1（0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μg/L）、bFGF（5、10、50、100、200μg/L）作用于半月板细胞,每样本设8个复孔和阴性对照组,分别于作用后48h和72h采用MTT法检测软骨细胞增殖情况,以确定各生长因子最佳效应浓度。同法设7个组,每组8个复孔,分别为：阴性对照组、bFGF最佳效应浓度组（50μg/L）、TGF-β1最佳效应浓度组（5μg/L）、IGF-1最佳效应浓度组（50μg/L）、bFGF和TGF-β1最佳效应浓度联用组、bFGF和IGF-1最佳效应浓度联用组、TGF-β1和IGF-1最佳效应浓度联用组,48h和72h用MTT比色法得出吸光度（A）值并分析软骨细胞的增殖效应。结果第3代半月板细胞扩增前后细胞均表达Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白。48h和72h50μg/L IGF-1,5μg/L TGF-β1及50μg/L bFGF浓度组与对照组相比均具有促细胞增殖作用,且差异有统计学意义（P〈0.05）;此即为各生长因子最佳效应浓度。生长因子联用：bFGF50μg/L与IGF-150μg/L联用、IGF-150μg/L与TGF-β15μg/L联用具有协同效应,差异有统计学意义（P〈0.05）;bFGF50μg/L与TGF-β15μg/L联用无协同效应,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论bFGF、TGF-β1、IGF-1单独使用均可体外扩增人胚半月板细胞,最佳效应浓度联用时bFGF/IGF-1、IGF-1/TGF-β1的扩增效果优于各自单独使用,可用于体外大量扩增种子细胞。     

p,p'-DDE,β-BHC单独及其联合对睾丸Sertoli细胞JNK MAPK信号转导通路机制的研究

目的:研究2,2-双-(对氯苯基)-1,1-二氯乙烯(p,p'-DDE)和β-六氯化苯(β-BHC)单独作用及联合作用对离体培养大鼠睾丸Sertoli细胞c-jun氨基末端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的作用机制。方法:从大鼠睾丸组织中分离Sertoli细胞进行离体原代培养2d,设溶剂(DMSO)为对照组,分别以终浓度为10、30、50μmol/L的p,p'-DDE,β-BHC及二者联合染毒Sertoli细胞24h,采用二步RT-PCR法检测Sertoli细胞JNK、c-junmRNA的表达水平。结果:①染毒24h后,对照组及10、30、50μmol/Lp,p'-DDE组Sertoli细胞JNKmRNA灰度比值分别为0.068±0.001、0.164±0.002、0.207±0.006、0.499±0.017;c-junmRNA灰度比值分别为0.122±0.002、0.157±0.006、0.218±0.007、0.289±0.004,随着p,p'-DDE剂量的增加,JNK、c-junmRNA的表达水平均逐渐升高,且10、30、50μmol/L组与对照组差异存在显著性(P<0.05)。β-BHC及联合染毒各组随着染毒剂量的增大,Sertoli细胞JNK、c-junmRNA表达水平也显著增加,且呈剂量依赖性关系(P<0.05)。②p,p'-DDE、β-BHC二者联合作用与单独作用相比,10μmol/L的p,p'-DDE,β-BHC及二者联合染毒组,JNKmRNA灰度比值分别为0.164±0.002、0.149±0.003、0.178±0.004;c-junmRNA灰度比值分别为0.157±0.006、0.131±0.004、0.172±0.002,联合染毒组JNK、c-junmRNA灰度比值均显著高于两者单独作用且存在显著性差异(JNK:P<0.05;c-jun:P<0.01);30、50μmol/L染毒剂量组JNK、c-junmRNA表达水平联合染毒组也显著高于单独染毒组(JNK:P<0.05,c-jun:P<0.01),而各DMSO对照组之间mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:p,p'-DDE、β-BHC及二者联合作用于睾丸Sertoli细胞后,JNK及其下游的c-jun基因转录水平均明显升高,且联合作用比单独作用更加明显。     

网膜素对成骨细胞向钙化血管平滑肌细胞分化的影响及其机理

目的 探讨网膜素对成骨细胞向钙化血管平滑肌细胞（CVSMCs)分化的影响。方法 网膜素处理VSMCs细胞,用茜素红S染色确定基质矿化范围,用PCR探测碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素表达,免疫印迹分析MAPK和Akt活性。结果 网膜素剂量依耐性抑制CVSMCs ALP及骨钙素mRNA转录(P <0. 05);与对照组比较,100 ng/ml,500 ng/ml及1000 ng/ml网膜素分别降低茜素红染色22%、41%及85% (P <0. 05);网膜素时间依耐性提高CVSMCs Akt活性(P <0. 05),对ERK、p38及JNK无影响;网膜素对VSMCs细胞内cAMP生成无明显影响。细胞用LY294002或HIMO处理后,网膜素对ALP活性及基质矿化的影响被消除了。结论 本研究结果首次表明网膜素通过PI3K/Akt途径抑制成骨细胞分化为CVSMCs,表明肥胖者网膜素降低会促进动脉钙化的发展,网膜素有抑制动脉钙化的作用。