瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的：构建血管生成抑制因子arresten基因的真核表达载体，并观察瘤内注射质粒DNA-脂质体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法：利用PCR方法，由重组质粒pGEM-Arr中扩增出基因；将该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮下注射Hepp2细胞，成瘤后以成功构建的质粒DNA-脂质体复合物瘤内注射，治疗后采用免疫组化方法检测肿瘤血管密度，并利用arresten基因瘤内注射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果：我们成功构建arresten基因真核表达载体(psTbAT)。实验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15．3个阳性血管／10个视野，对照组平均112．5个阳性血管／10个视野)。结论：瘤内注射arresten基因质粒-DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成，并能抑制移植瘤的生长。     

表达白细胞介素-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用

目的 探讨瘤内注射mIL-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用。方法：构建真核表达质粒载体pDC511mIL-12，ELISA方法检测质粒载体在真核细胞中的表达，淋巴母细胞增殖法检测mIL-12的生物学活性；分别于小鼠肝癌H22皮下移植瘤内直接注射质粒DNA，观察各组小鼠存活时间、肿瘤体积变化及各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活性：注射质粒DNA后1月进行瘤体组织病理学观察：结果：mIL-12基因治疗组与空载体对照组相比，肿瘤生长显著受抑制(F=4．10，P=0．03)，小鼠存活期显著延长(X^2=4．48，P=0．03)．并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强。质粒DNA瘤内注射1月后，pDC511mIL-12组肿瘤病灶炎性细胞浸润明显，病灶内肿瘤细胞广泛坏死。结论：瘤内注射mIL-12表达质粒DNA可抑制小鼠肝癌皮下移植瘤生长，能提高机体抗肿瘤免疫应答。     

血管内皮生长因子-C干扰对人类结肠癌裸鼠移植瘤模型淋巴管生成的影响

 目的　构建携带有RNA干扰片段的腺病毒载体Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP,探讨人类结肠癌BALB／c裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射腺病毒载体Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP抑制血管内皮生长因子-C（VEGF-C）表达、结肠癌生长以及结肠癌淋巴管生成的效果。方法　选择针对人类VEGF-C mRNA的特异性siRNA靶序列,设计合成其相应的双链DNA,利用 BamHI、HindⅢ双酶切插入pDC316-EGFP-U6载体后构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,再与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,同源重组,酶切鉴定,包装扩增后得到重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6。裸鼠皮下注射LoVo细胞构建人类结肠癌皮下移植瘤模型24只,随机分为4组（每组6只）：以腺病毒、空病毒、裸siRNA以及PBS分别进行瘤内原位注射干预,计算肿瘤体积变化并绘制生长曲线,使用抗LYVE-1单抗和抗CD34单抗分别染色瘤内的血管和淋巴管,检测瘤内淋巴管和血管生成情况,计算微血管密度（MVD）,微淋巴管密度（LVD）。结果　腺病毒组肿瘤体积明显小于其他各组,腺病毒组与PBS对照组LVD 分别为8.47±2.1,17.35±4.7（P＜0.05）,腺病毒组与PBS对照组MVD分别为22.65±6.04,23.19±7.63（P＞0.05）。结论　实验设计并合成的腺病毒载体介导的VEGF-C siRNA,在人类结肠癌裸鼠移植瘤模型中,瘤内注射腺病毒载体能显著抑制移植瘤的生长和肿瘤淋巴管生成,而对肿瘤血管生长无显著影响。     

小干扰RNA对人胰腺癌细胞移植瘤血管生成的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对裸鼠皮下人胰腺癌PANC-1细胞移植瘤血管生成的影响。方法构建人胰腺癌PANC-1细胞40只裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组。两组针对VEGF的siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2)通过脂质体法行瘤内和瘤周注射;注射空质粒组作为实验对照组;未注射组作为空白对照组。注射1次/3天,共10次,末次注射3天后,剥离瘤体,免疫组化染色法观察VEGF阳性染色及微血管参数,RT-PCR检测瘤组织VEGF-mRNA表达。结果 PU-VEGFsiRNA2组移植瘤VEGF-mRNA及转染PU-VEGF-siRNA后肿瘤组织微血管密度(MVD)表达均较空质粒组及空白对照组低(P0.05)。而PU-VEGF-siRNA1组未发现差别(P0.05)。结论 siRNA能在体内抑制胰腺癌VEGF表达,抑制肿瘤血管生成。     

血管生成抑制因子arresten 的真核表达体系的建立

  目的 构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法 用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2-arresten将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测arresten mRNA表达，免疫蛋白印迹技术（Westem-blot）测arresten蛋白的表达。结果 经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞，RT-PCR、Westem-blot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达。结论 获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础。     

慢病毒介导的RNAi沉默TLR4基因对人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响北大核心CSCD

目的探讨TLR4基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体对人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤TLR4基因表达和移植瘤生长的影响。方法构建4个miR-TLR4质粒和一个阴性对照质粒,选择干扰效果最明显的质粒进行慢病毒包装。建立人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤模型,随机分成实验组、阴性对照组和空白对照组。隔天1次向各组动物肿瘤内分别注射TLR4 miRNA慢病毒颗粒、携带无关序列的慢病毒颗粒或0.2 ml 0.9%氯化钠溶液,共5次,测量各组肿瘤体积的大小,绘制肿瘤生长曲线;11天后处死裸鼠,应用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测移植瘤中TLR4基因的表达。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的移植瘤生长速度明显减慢(P<0.05),并且实验组移植瘤细胞TLR4 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 TLR4 miRNA慢病毒载体瘤内注射可抑制人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤的生长。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

Rb94对人肺腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及SphK表达影响的研究*

目的:Rb94基因转染裸鼠肺腺癌皮下移植瘤,观察Rb94基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及对鞘氨醇激酶（sphingosine kinase ,SphK）表达的影响。方法:收集一定数量的对数生长期A549 细胞,生理盐水重悬后每只裸鼠右后肢皮下接种5 × 106/0.1mL A549 细胞悬液,待瘤体生长至一定体积后随机分为4 组,分别为对照组、空载体组、脂质体组、转染Rb94基因组;每组裸鼠瘤体内分别注射PBS 、质粒pIRES 、脂质体（lipofectamine）、质粒pIRES-Rb94,观察肿瘤生长情况并检测抑瘤率;裸鼠脱颈处死后,采用Western bolt法检测瘤组织中Rb94基因表达情况,并采用实时RT-PCR 和免疫荧光法（immunofluorescence,IF ）观察其对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤中SphK表达的影响。结果:对照组及转染组裸鼠在接种部位均有移植瘤生成;与空白对照组、脂质体组、空载体组相比,转染Rb94 基因组的裸鼠移植瘤的生长速度明显减慢,肿瘤的体积较小,重量较轻,有显著性差异（P<0.05）,而3 个对照组之间,无显著性差异（P>0.05）;空白对照组、空载体组、脂质体组抑瘤率分别为0、11.78% 、7.86% ,而转染Rb94基因组平均抑瘤率高达51.99% ,肿瘤生长明显抑制;SphK1 在mRNA 和蛋白水平表达下调而SphK2 表达上调。结论:Rb94基因成功转染裸鼠肺腺癌皮下移植瘤;Rb94基因抑制裸鼠皮下肿瘤生长;Rb94基因抑制SphK1 的表达,增强SphK2 的表达。      

siRNA沉默PI3K基因激活FoxO3α基因并抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤生长的实验研究

目的:探讨应用小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)基因对人乳腺癌细胞MCF-7中抑癌基因FoxO3α的表达及人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长的影响.方法:构建PI3K基因siRNA质粒Psilencerl.0-U6-PI3K-siRNA;乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠背部皮下接种,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤动物模型,成瘤后将实验动物分3组,每组9只,1组注射Psilencerl.0-U6-PI3K-siRNA质粒、另2组分别注射Psilencerl.0-U6空质粒或0.9%的氯化钠溶液作为对照.观察肿瘤体积变化、裸鼠生存时间;并用Western印迹法检测瘤组织中FoxO3α和PI3K的表达.结果:PI3K-siRNA质粒治疗组裸鼠的肿瘤体积明显缩小(P＜0.01),平均生存时间显著延长(P＜0.01);肿瘤内PI3K基因表达水平明显下降,而FoxO3α基因的表达水平明显升高.结论:PI3K基因siRNA能够明显抑制人乳腺癌裸鼠移植模型的PI3K基因的表达,上调抑癌基因FoxO3α的表达,抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠的生存时间.     

shRNA干扰HERG钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤

目的：探讨发卡结构小片段RNA（small hairpin interfering RNA，shRNA）干扰人ERG（human ether-α—go-go—related gene，HERG）钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤的疗效和作用机制。方法：用真核转录载体mU6pro构建针对herg基因的发卡状RNA干扰质粒（shRNA-herg）。18只BALB／c裸小鼠皮下接种成神经细胞瘤SH—SY5Y细胞，建立裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤模型，当瘤体积达到100mm^3时随机分成3组，分别为生理盐水组（Ⅰ）、对照质粒组（Ⅱ）、干扰质粒组（Ⅲ）。各组瘤内分别注射生理盐水、对照质粒、干扰质粒，以后每7d注射1次，连续15d。观察各组肿瘤生长情况，RT—PCR测定肿瘤组织herg基因mRNA含量变化，免疫组化检测肿瘤组织中HERG钾通道蛋白变化。结果：经治疗后，第Ⅲ组肿瘤生长受到明显抑制，Ⅱ、Ⅲ组抑瘤率分别为3．04％和29．78％（P〈0．05）。肿瘤组织内berg基因mRNA含量、HERG钾通道蛋白，Ⅲ组较Ⅰ、Ⅱ组表达减弱。结论：构建的shRNA干扰质粒可通过靶向性抑制herg基因及其编码的HERG钾通道蛋白的表达，有效地抑制人成神经细胞瘤的生长。     

arresten基因转染对裸鼠实验性结肠癌肝转移的抑制作用

背景与目的:肝转移是晚期结肠癌患者最常见的致死原因,也是最常见的内脏转移,高达50%以上的结肠癌患者都会出现肝转移.本研究探讨arresten基因转染对人结肠癌LoVo细胞形成的裸鼠实验性结肠癌肝转移的影响.方法:通过脂质体转染法将arresten基因导入LoVo细胞,RT-PCR、Western blot分别检测arresten在mRNA、蛋白水平的表达,四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测arresten对LoVo细胞增殖的影响;通过建立裸鼠实验性结肠癌肝转移模型了解arresten对肿瘤转移的抑制作用;FⅧRag多克隆抗体染色的免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度(microvessel density,MVD).结果:RT-PCR、Western blot结果显示arresten基因成功导入LoVo细胞并有arresten蛋白的表达.MTT比色法显示不同浓度的arresten对LoVo细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05).导入arresten基因的LoVo细胞转移率为(25.1±2.1)%,低于未导入arresten基因的LoVo细胞的(87.1±1.2)%和对照组的(87.1±1.5)%,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSecTag2-arresten组裸鼠形成的肿瘤结节数为4.5 0.5,低于另外两组的19.6±2.5和20.4±2.5,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSeeTag2-arresten组形成的肿瘤MVD为15.3±3.5,低于另外两组(分别为42.2±2.6、45.6 5.1),其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:arresten能抑制结肠癌肝转移,其作用机制可能与arresten抑制肿瘤血管生成有关.     

TGFβ1质粒DNA直接瘤内注射地小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨裸ＤＮＡ质粒ＰＭＡＭｎｅｏ－ＴＧＦβ１小人直接注射后的表达及其对肿瘤生长的影响。方法 肺腺癌细胞株ＬＭ３小鼠背部皮下接种,两周后瘤。瘤体内多点多次直接注入质粒ＤＮＡＰＭＡＭｎｅｏＴＧＦβ１,并设空质粒和生理盐水注射组为对照,观察肿瘤生长情况。于第８周将小鼠处死,取新鲜的铰瘤组织提取ＲＮＡ,行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,并病理制片观察肿瘤组织结构的变化。结果ＴＧＦβ基因治疗组肿瘤生长速度增快,但各     

瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响

目的研究瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响,并为后续动物实验探索最佳体内转染DNA-脂质体比例.方法以不同比例之质粒DNA-Lipofectamine 2000转染肝癌细胞系HepG-2细胞,瞬时转染经RT-PCR证实目的基因已转入细胞内48 h后收集上清,上清液与血管内皮细胞以划痕法共培养,计算迁移率.结果不同比例转染细胞的上清液均可抑制内皮细胞的迁移,以DNA-脂质体比例1:1,抑制率最高.结论瞬时转染Arresten基因可抑制血管内皮细胞的迁移,并为后续动物实验奠定一定的基础.     

Anti-angiogenic cues from vascular basement membrane collagen

Vascular basement membrane is an important structural component of blood vessels and has been shown to interact with and modulate vascular endothelial behavior during angiogenesis. During the inductive phase of tumor angiogenesis, this membrane undergoes many degradative and structural changes and reorganizes to a native state around newly formed capillaries in the resolution phase. Such matrix changes are potentially associated with molecular modifications that include expression of matrix gene products coupled with conformational changes, which expose cryptic protein modules for interaction with the vascular endothelium. We speculate that these interactions provide important endogenous angiogenic and anti-angiogenic cues. In this report, we identify an important antiangiogenic vascular basement membrane-associated protein, the 26-kDa NC1 domain of the alpha1 chain of type IV collagen, termed arresten. Arresten was isolated from human placenta and produced as a recombinant molecule in Escherichia coli and 293 embryonic kidney cells. We demonstrate that arresten functions as an anti-angiogenic molecule by inhibiting endothelial cell proliferation, migration, tube formation, and Matrigel neovascularization. Arresten inhibits the growth of two human xenograft tumors in nude mice and the development of tumor metastases. Additionally, we show that the anti-angiogenic activity of arresten is potentially mediated via mechanisms involving cell surface proteoglycans and the alpha1beta1 integrin on endothelial cells. Collectively, our results suggest that arresten is a potent inhibitor of angiogenesis with a potential for therapeutic use.     

arresten在CHO细胞的表达及其生物学效应

目的 初步探讨血管生成抑制因子arresten在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的表达及其生物学效应。方法 用脂质体转染法将真核表达载体pSecTag-arresten导入CHO,抗生素Zeocin筛选获得阳性克隆。RT—PCR检测arresten在mRNA水平的表达,Western blot检测arresten在蛋白水平的表达。将人脐静脉内皮细胞（huvec）分为加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组及加含arreten的上清培养液组,TransweH小室检测arresten对huvec细胞迁移的影响,Mamgel胶体外管腔生成试验检测arresten对huvec细胞血管形成能力的影响。结果 RT—PCR和Western blot检测显示,arresten在mRNA水平与蛋白水平均有表达。迁移抑制曲线显示,含arresten组的迁移抑制率明显高于对照组（P〈0．05）。加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组和加含arresten的上清培养液组细胞形成的血管腔分别为16±2、13±1和7±2个,加含arresten的上清培养液组显著低于其他两组（P〈0．05）。提示arresten对huvec细胞的迁移和血管形成具有抑制作用。结论成功构建arresten的真核表达体系,并发现arresten因子可抑制huvec细胞迁移和管腔形成,这可能是其抑制血管生成的途径之一。     

白细胞介素2质粒复合物治疗后小鼠肝癌的组织学变化

目的 探讨瘤体内直接注射白细胞介素2质粒／阳离子脂质体复合物治疗小鼠肝癌的效果和机制。方法 将小鼠白介素2表达质粒（VR1110）与阳离子脂质体（Transfectam)按适当比例混合而形成复合物（VR1110／Transfectam)。通过瘤体内接注射此复合物治疗小鼠肝癌模型,观察治疗后肿瘤积变化、组织学变化及表达情况。结果 瘤体内注射VR1110／Transfectam后,可在肿瘤组织中检测到小鼠IL－2mRNA的表达。VR1110／与Tansfectam治疗组肿瘤生长较其它对照组明显减慢,第1次治疗后第12天肿瘤体积明显小于其它组（P＜0．05）。治疗组小鼠均可见肿瘤组织大量坏死,炎性细胞浸润,及CD4^ 、CD8 淋巴细胞。结论 瘤体内直接注射VR1110／Transfectam复合物对小鼠肝癌的治疗作用明显,增强了小鼠机体对肝癌细胞的免疫学反应。     

经尿道灌注自杀基因治疗大鼠膀胱癌的实验研究

目的:探讨经尿道膀胱灌注脂质体和逆转录病毒载体介导的自杀基因(HSVtk),观察在羟基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)作用下大鼠膀胱肿瘤的生长情况.方法:用N-甲基-亚硝基脲(MNU)膀胱灌注建立大鼠原位膀胱癌模型.经尿道膀胱灌注脂质体、逆转录病毒载体HSVtk基因,随后腹腔内注射GCV,连续6天.结果:经尿道膀胱灌注HSVtk基因后48h,RT-PCR检测出膀胱肿瘤中HSVtk基因表达.逆转录病毒组和脂质体组膀胱总重量与裸质粒组和对照组相比有显著差异,表明膀胱肿瘤的生长被抑制.TUNEL法原位检测肿瘤组织中凋亡细胞不仅出现在表层细胞,而且深层细胞大量凋亡,推测旁观者效应可能发挥了一定作用.结论:经尿道膀胱灌注脂质体DNA或重组逆转录病毒载体可以向肿瘤转导HSVtk基因.HSVtk/GCV系统能抑制大鼠原位膀胱肿瘤的生长,显示出抗肿瘤作用.     

The effect of TGFβ1 on murine tumor growth following direct intratumoral injection of plasmid DNA

In order to investigate TGFβ1 gene expression and its effect on murine tumor growth following direct intratumoral injection of naked plasmid DNA encoding human TGFβ1, LM₃ murine lung adenocarcinoma cells were inoculated subcutaneously to T₇₃₉ mice and grew to tumor nodules in 2 weeks. Multiple direct intratumoral injection of plasmid DNA, PMAMneo- TGFβ1, were given and compared with saline or vector plasmid administration groups. The growth of tumor was observed till the 8th week when the mice were killed for Northern blot analysis and histopathological study of tumoral tissue. The results showed that the growth of tumor was boosted in the TGFβ1 gene treated mice as compared with the control groups, whereas there was no significant difference in the metastatic behavior. Northern blot showed efficient expression of TGFβ1 mRNA in the treated group. The present study indicated that TGFβ1 may stimulate tumor growthin vivo through certain mechanisms. And direct intra-tumoral injection of nude plasmid DNA may be a promising gene transfer strategyin vivo. This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 39370761).