转染抗VEGF发夹状核酶基因白血病细胞模型的建立

 目的 建立转染抗血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶基因的白血病细胞模型,探讨发夹状核酶对白血病细胞系K562 VEGF基因表达的效应。方法 采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体（pcDNA3-RZ）转染入人白血病细胞系K562,G418抗性筛选获得阳性克隆,转染VEGF pcDNA3-RZ和空载体（pcDNA3）的细胞组均有抗性细胞生长,分别命名为K562-RZ和K562-PC;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转染入K562细胞,荧光定量PCR和western blot方法分别检测白血病细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量;同时测定K562-RZ,K562-PC和 K562三组培养上清刺激内皮细胞生长的情况。结果 抗VEGF pcDNA3-RZ成功转入白血病细胞系K562,G418筛选2周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562-PC细胞相比,转染VEGF核酶基因的K562-RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低;K562-RZ组培养上清对内皮细胞的刺激作用明显弱于K562-PC组。结论 建立了转染VEGF发夹状核酶基因的白血病细胞模型,抗VEGF发夹状核酶基因可明显下调白血病细胞VEGF的表达,为抗肿瘤治疗提供了新的线索。     

重组人类核心蛋白聚糖对白血病K562细胞增殖的影响

 【摘要】　目的　观察重组人类核心蛋白聚糖（rhDCN）对白血病 K562细胞生长抑制、凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine 2000脂质体介导转染对数生长期的白血病K562细胞,实验分组为0.9 % NaCl溶液组、pcDNA3.1（+）／K562组、pcDNA3.1（+）-DCN／K562组和脂质体组。经瑞特染色观察转染后细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1及Bax的表达。结果　pcDNA3.1（+）-DCN／K562组瑞特染色呈现典型的凋亡形态学改变。MTT结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组转染24 h细胞增殖抑制率为（16.14±1.08）%,转染48 h为（14.07±1.01）%,转染72 h为（20.29±1.19）%,明显高于对应时间点其他组增殖抑制率,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。FCM检测结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组凋亡率为（20.15±1.31）%、细胞的G0／G1期细胞百分率为（51.15±0.57）%,与其他各组比较增加明显,差异有统计学意义（均P＜0.05）。Western blot结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组与其他各组比较bcl-xl、Mcl-1蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高。结论　rhDCN重组质粒可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,rhDCN对细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1、Bax的影响可能是其发挥作用的机制。     

人核糖体蛋白L6对白血病K562/A02细胞耐药性的影响

目的观察核糖体蛋白L6(RPL6)表达的改变对白血病耐药性的作用。方法通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1( )分别构建正向插入和反向插入的RPL6cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562/A02细胞,以MTT观察其对化疗药物耐药性的作用。结果转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562细胞增强3.25倍,转染反义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562/A02细胞降低62%。结论RPL6基因过表达在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的：探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1（CCNL1）基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法：构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K（含有KOZAK序列）的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果：在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论：在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

VEGF165-PE38重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的构建血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物（PE38）基因的真核融合表达载体,研究其在HEK293细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,重组质粒经限制性内切酶及DNA序列测定证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞,然后用RT—PCR及ELISA法检测VEGF165-PE38融合蛋白在HEK293细胞的表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT—PCR及ELISA法检测证实重组基因可在HEK293细胞表达。结论VEGF165-PE38融合基因可在HEK293细胞中表达,为进-步研究其对肿瘤血管内皮细胞的靶向毒性及临床应用奠定基础。     

下调WT1基因对K562细胞血管内皮生长因子表达的影响

 目的　探讨WT1基因沉默对人类白血病细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法　将已构建的WT1小发夹RNA（shRNA）质粒载体转染入K562细胞，流式细胞术检测转染效率并对转染细胞进行分选，实时荧光定量PCR检测细胞转染前后WT1及VEGF基因mRNA的表达变化，用ELISA检测转染前后细胞培养液中VEGF浓度的变化。结果　转染48 h，WT1shRNA质粒转入K562细胞，转染效率为（65±4.5）%，通过流式细胞术分选，可以得到纯度达98 %以上的WT1shRNA阳性细胞，转染后的K562细胞WT1及VEGF基因mRNA表达较转染前及对照组均明显降低（P＜0.05），转染后48、72 h细胞培养液中VEGF的含量较对照组明显降低（P＜0.05）。结论　WT1干扰质粒在体外可以抑制白血病细胞株VEGF的表达，提示WT1基因可能通过上调VEGF基因的表达而参与白血病的血管新生。     

转染KISS-1对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的 影响

 目的 探讨KISS-1基因对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的影响。 方法 通过脂质体介导将pcDNA3.1-KISS-1转染人食管鳞癌细胞EC-1,用Western blot法检测转染前、后KISS-1蛋白的表达。将单纯EC-1细胞、稳定转染空质粒的EC-1细胞、稳定转染pcDNA3.1-KISS-1的EC-1分别接种于BALB/c-nude裸鼠,构建裸鼠食管鳞癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情 况,测量肿瘤体积和瘤质量并绘制肿瘤生长曲线;免疫组织化学和半定量RT-PCR技术检测肿瘤组织中KISS-1蛋白和mRNA的表达。 结果 KISS-1基因转入食管鳞癌EC-1细胞,KISS-1蛋白的表达（1.143±0.218）较空质粒转染组（0.745±0.130）和对照组（0.855±0.184）明显增加（P<0.05）,转染KISS-1基因组裸鼠较空质粒转染组和对照组肿瘤生长速度慢,体积（949.42±102.26）mm3与空质粒转染组（1339.82±72.23）mm3和对照组（1384.04±97.07）mm3相比明显减小（P<0.05）,瘤体重量（0.498±0.654）g与空质粒转染组（0.638±0.066）g和对照组（0.676±0.108）g相比明显减轻（P<0.05）。 结论 通过基因转染的方法能表达有活性的KISS-1,并能抑制裸鼠食管癌移植瘤的生长。     

pcDNA3.1-KISS-1真核表达载体的构建及其对EC1细胞转移的抑制作用

 目的 克隆人食管组织KISS-1基因及构建真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,并观察其在食管癌EC1细胞中的表达及对EC1细胞侵袭及运动能力的影响。 方法 从人正常食管组织中提取总RNA,设计特异性引物,通过逆转录聚合酶联链反应（RT-PCR）扩增KISS-1基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-KISS-1,酶切鉴定及测序分析后用Lipofectamine脂质体将其转染到食管癌细胞,Western blot法检测其蛋白在EC1细胞中的表达情况;应用细胞运动实验及重建基底膜侵袭实验分析KISS-1表达对EC1细胞运动和侵袭能力的影响。 结果 成功克隆了人KISS-1基因全长编码序列,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,脂质体转染后KISS-1基因在EC1细胞中成功表达;转基因组细胞的运动能力（174.6±14.24）和体外穿越重建基底膜的能力（90.44±12.83）明显低于转空质粒组（222.6±30.08,110.22±15.87）和对照组EC1细胞（234.40±14.72,124.78±18.14）（P均<0.05）。 结论 重组pcDNA3.1-KISS-1真核表达质粒构建成功,并且KISS-1对食管癌细胞的侵袭和运动能力具有抑制作用。     

基因CGI-100真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的 构建CGI-100基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法 采用DNA重组技术,将CGI-100基因亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒中,重组为pIRES2-EGFP- CGI-100,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的 基因CGI-100的表达,采用体外培养技术,通过pIRES2EGFP- CGI-100质粒转染K562细胞前后的生长曲线.结果 pIRES2-EGFP- CGI-100在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论 CGI-100表达产物可能是1个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,CGI-100基因可能是1个具有生物学功能的白血病未知基因.     

高表达CypA肝癌细胞系的建立及其功能初步研究

目的：构建含人全长CypA cDNA的真核表达质粒,建立高表达CypA蛋白的肝癌细胞系,为进一步研究CypA在肝癌中的功能和作用机制提供细胞模型。方法：将人全长CypA cDNA序列克隆后,连接至真核表达载体pcDNA3.1中,再将构建的真核表达载体转染至FHCC98肝癌细胞中,经G418加压筛选后获得稳定表达CypA的肝癌细胞株;免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况;MTT法测定细胞的增殖速率。结果：真核表达载体pcDNA3.1-CypA经酶切、测序鉴定,结果正确;免疫印迹结果显示,稳定转染后细胞的CypA表达水平显著高于空载体转染和未转染的细胞;与对照相比,稳定高表达CypA的细胞增殖速度加快。结论：成功构建了含有人全长CypA cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1-CypA;建立了稳定高表达CypA的FHCC-98肝癌细胞系;CypA的高表达可以促进FHCC98细胞的增殖。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的：构建fascin基因的pcDNA3.1（＋）表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白（F-actin）的变化。方法：应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1（＋）重组,获得重组表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果：成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1（＋）载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1（＋）-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论：成功构建了pcDNA3.1（＋）-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

法舒地尔对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨法舒地尔对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 采用不同浓度的法舒地尔处理胃癌MGC-803细胞,检测细胞数目;选择无显著细胞毒性的3组浓度（10、25、50 μmol／L）法舒地尔进行后续实验,将经药物处理的胃癌MGC-803细胞作为处理组,而未经药物处理的胃癌MGC-803 细胞作为对照组;细胞培养0、24、48、72、96 h后,CCK-8法检测细胞增殖倍数;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞侵袭能力;Western blotting检测细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶14（MMP-14）和上皮间质转化（EMT）的标志蛋白波形蛋白（Vimentin）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达水平。结果 CCK-8法检测结果显示,法舒地尔以剂量依赖性的方式抑制胃癌MGC-803细胞的生长,法舒地尔浓度越高,处理组的细胞数量越少,增殖倍数明显降低（P＜0.01）;划痕实验结果表明,处理组伤痕愈合率明显较对照组降低,且法舒地尔浓度越高,处理组伤痕愈合率越低（P＜0.01）;Transwell结果显示,与对照组比较,处理组侵袭的细胞数目明显减少（P＜0.01）;与对照组比较,法舒地尔明显下调VEGF、MMP-9、MMP-14和Vimentin蛋白的表达水平,而上调E-cadherin蛋白的表达水平。结论 法舒地尔可抑制胃癌MGC-803细胞的的增殖、迁移和侵袭能力,降低MMP-9、MMP-14、VEGF表达水平,为胃癌的治疗研究提供新思路和理论基础。     

人反义VEGF基因表达载体的构建及其对卵巢癌细胞增殖的影响

目的：构建人反义VEGF基因真核表达载体,进行抗血管生成治疗卵巢癌实验。方法：RT－PCR法获得人VEGF基因,将VEGF基因反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定结果。用此真核表达载体转染人卵巢癌细胞HO－8910,G418筛选获得阳性克隆,RNA斑点杂交鉴定HO－8910细胞中VEGF表达。Western blot及间接免疫荧光法检测转染前后HO－8910 细胞中VEGF蛋白表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状及裸鼠体内致瘤性。结果：RT－PCR法得到VEGF基因,并获得反向构建的VEGF真核表达载体。VEGF反义RNA部分阻断了HO－8910细胞中VEGF表达,转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。裸鼠体内致瘤性降低。结论：成功构建了反义VEGF基因真核表达载体,该载体可明显抑制卵巢癌细胞增殖,为卵巢癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

人抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建与鉴定

[目的]构建人抑癌基因FHIT真核细胞表达载体。[方法]采用PCR方法，从人胎脑组织的总cDNA中扩增出444bp的人FHIT cDNA片段，然后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）B中，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；用该表达质粒转染COS-7细胞，Western blot法检测FHIT蛋白的表达情况。[结果]人FHIT基因cDNA以正确方向插入到真核细胞表达载体DcDNA3．1／myc-His（-）B中；转染COS-7细胞后，可见转染细胞有Fhit蛋白的表达。[结论]本实验成功地构建了人抑癌基因FHIT的真核表达质粒pcDNA3．1／myc-His（-）B-FHIT，为研究FHIT基因在肿瘤的发生中的作用提供了有效的工具。