sFv及重组人IFN—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体，观察其在成骨肉瘤细胞9901中的瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增交经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv-rhIFN－α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，成功构建表达载体pEGFP-sFv-rhIFN－α，并在该载体转梁人成骨肉瘤细胞9901后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实sFv-rhIFN－α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转梁人成骨肉瘤细胞9901中观察到sFv-rhIFN－α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体便于观察转染细胞中sFv-rhIFN－α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

HSV-TK2重组TNF-α融合基因表达载体的构建及在肝细胞癌细胞中的瞬时表达

目的：构建双特异性细胞因子融合基因表达载体及在肝细胞癌细胞中瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-TNF-α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点间，成功地构建表达载体pEGFP-TK-TNF-α仅，并在该载体转染人肝细胞癌细胞HCC9204后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实TK-TNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点问，并在转染人肝细胞癌细胞7901中观察到TK-TNF-α融合基因绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-TNF-α表达载体便于观察转染细胞中融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为双特异细胞因子基因疗法提供有利条件。     

胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位研究

目的：研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位。方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术，从pGEM—T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段，将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点，克隆至真核表达载体pEGFP-N1。将测序正确的阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞，激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。结果：经测序证实，GCRG213正确克隆入真核表达载体pEGFP—N1，组成阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213。测序正确的pEGFP-N1～GCRG213重组子经脂质体转染COS-7细胞，激光共聚焦显微镜观察GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。结论：GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。     

PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与PTEN融合蛋白真核表达载体的构建和表达,观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响。方法 （1）以RT—PCR方法扩增人的PTEN基因,经T—A亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP—N1,构建融合蛋白表达载体。采用阳离子聚合物转染试剂,将重组质粒DNA瞬时转染至SHG-44细胞,检测融合蛋白的表达。（2）G418筛选出稳定转染的细胞（SHG-44-Z）,并扩增培养,通过细胞形态学、生长曲线观察PTEN基因对细胞形态和增殖的影响,免疫组织化学法检测对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。结果 （1）重组质粒阳性克隆的测序结果与GenBank报告序列一致。瞬时转染的SHG-44细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光,流式细胞仪可检测到荧光表达量为17．8％,免疫细胞化学法检测到外源PTEN蛋白表达。证实pEGFP—PTEN融合蛋白表达载体构建成功,并在胶质瘤细胞得以正确表达。（2）转染组SHG-44-Z细胞株的生长增殖受到明显抑制,第7天细胞计数为未转染组细胞数的27．8％,且GFAP表达上调。结论携带绿色荧光蛋白的PTEN基因真核表达载体的构建,为进一步研究PTEN的作用机理及抑癌效应奠定了基础。     

pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体的构建及其对人鼻咽癌细胞增殖的影响

目的：构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并观察其对鼻咽癌细胞株 CNE1体外增殖的影响。方法：提取 CNE1细胞中总 RNA,RT －PCR 扩增 NPRL2并克隆至 pEGFP －N1载体,鉴定出阳性克隆送测序,以重组质粒转染 CNE1细胞。通过 Western blot 检测转染细胞中 NPRL2蛋白的表达,CCK －8法检测细胞增殖的变化。结果：成功构建了 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体,Western blot 法检测到 NPRL2蛋白的表达, CCK －8法检测发现 NPRL2能够明显抑制肿瘤细胞增殖（P ＜0．05）。结论：成功构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并转染至 CNE1细胞,NPRL2可抑制肿瘤细胞的增殖。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的：构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法：通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果：流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16.1% vs 4.5%）;TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论：重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒的构建与卵巢癌细胞内表达

目的构建GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒,测定其在卵巢癌细胞中的表达.方法以GFP基因为报告基因,hTRAIL为目的基因,将hTRAIL基因插入GFP基因上游,构建成GFP-hTRAIL融合基因表达质粒,并通过酶切和测序对重组体进行鉴定.经脂质体法转染培养的卵巢癌细胞,用荧光显微镜观察GFP 的表达.流式细胞仪分析转染后卵巢癌细胞的凋亡率.结果测序结果证实构建的为GFP-hTRAIL融合基因表达载体.质粒经脂质体转染后,有大约20% 的卵巢癌细胞表达融合蛋白.流式细胞仪结果表明转染该质粒可诱导卵巢癌细胞凋亡.结论构建了1个可以表达GFP-hTRAIL融合蛋白的新质粒,该表达载体的构建成功为进一步开展卵巢癌的基因治疗奠定了基础.     

hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了hSesn3蛋白.     

ABCE1基因pEGFP重组表达载体构建及转染小细胞肺癌细胞

目的:构建ABCE1基因的pEGFP重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1,并将其转染至小细胞肺癌细胞(NCI-H446),观察其表达,并检测转染前后细胞增殖情况.方法:RT-PCR扩增ABCE1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1重组获得重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1.经酶切,电泳,DNA测序鉴定后应用Fugene-HD将重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1及空载体pEGFP-C1分别转染NCI-H446细胞,观察pEGFP-C1-ABCE1和pEGFP-C1在小细胞肺癌细胞的表达,MTT法检测转染ABCE1基因对小细胞肺癌细胞增殖的影响.结果:ABCE1基因cDNA片段成功重组到pEGFP-C1载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的cDNA片段为ABCE1基因.荧光显微镜观察转染pEGFP-C1- ABCE1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白主要在胞浆表达而转染pEGFP-C1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白在胞浆及胞核均有表达.MTT实验提示转染pEGFP- C1-ABCE1的细胞与转染pEGFP-C1和未转染的同类细胞相比增殖能力明显增加.结论:成功构建了pEGFP-C1-ABCE1真核细胞重组表达载体,并将该载体转染入小细胞肺癌细胞,该载体的绿色荧光主要在NCI-H446细胞胞质表达,提示ABCE1基因可能主要在胞质表达.该基因与小细胞肺癌的增殖活性有关.     

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列，并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定，并转染到工具细胞HEK293T中，提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位，最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中，酶切鉴定片断为387 bp，并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达，分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体，pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质，LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。     

3*Flag-hPlk4真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达和定位

目的:构建3*Flag-hPlk4真核表达载体,并证实重组表达载体在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以pGEX-4T-2-hPlk4为模板,利用聚合酶链反应扩增hPlk4基因cDNA全长,并将其克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到U2OS骨肉瘤细胞中,Western blot检测重组蛋白的表达.同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hPlk4表达载体在U2OS细胞中的定位,进一步利用免疫沉淀的方法纯化人源Plk4蛋白.结果:hPlk4基因cDNA全长成功构建到3*Flag真核表达载体中,Western blot检测到含有3*Flag的人源Plk4融合蛋白表达,进一步在U2OS骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和细胞核周,并成功纯化hPlk4蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk4真核表达质粒,同时鉴定了融合蛋白的表达,并成功纯化人源Plk4蛋白.3*Flag-hPlk4蛋白主要定位在细胞质和细胞核周.     

hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的:构建pEGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以pGEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至pEGFP-C1中,pEGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77kDa,pEGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。     

转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

SRG基因的克隆及原核表达

目的克隆SRG基因、原核表达并鉴定。方法从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得SRG基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的SRG基因亚克隆到pET-28(a )表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG诱导表达2h~6h,做SDS-PAGE分析,鉴定SRG蛋白的表达。结果DNA测序证明,获得了SRG基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,SRG蛋白获得高效表达,其相对分子质量为22kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论SRG基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨SRG基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

3*Flag-hSesn1重组质粒的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的:构建3*Flag-hSesn1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以GST-hSesn1为模板,利用聚合酶链反应扩增hSesn1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中.将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到MG-63骨肉瘤细胞中,提取总蛋白进行Western blot检测.进一步利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSesn1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化人源Sesn1蛋白.结果:hSesn1基因的cDNA全长成功构建到3*Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测到了含有Flag标签的人源Sesn1融合蛋白表达,且在MG-63骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化人源Sesn1蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hSesn1真核表达质粒,同时鉴定了其融合蛋白的表达,并纯化人源Sesn1蛋白.3*Flag-hSesn1蛋白主要定位在细胞质,部分定位于细胞核周.