人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化、鉴定

用 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 Ｅｃｏ ＲⅠ双酶酶切经改造的 Ｐ Ｕ Ｃａ Ｆ Ｇ Ｆ质粒，获得了人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ）基因，将该基因片段插入表达载体ｐｋｋ２２３３，筛选得到了重组质粒ｐｋｋｈａ Ｆ Ｇ Ｆ。加 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导该质粒转化的大肠杆菌 Ｊ Ｍ １０９ 表达，ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ在发酵液中的表达水平约８０ｍ ｇ／ Ｌ。用肝素亲和层析的方法，获得了电泳纯ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ样品。纯化过程中ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ活力回收率为６５％ 。纯化ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ样品的比活性为 Ｅ Ｄ５０ ４．６ｎｇ／ｍ ｌ，理化及生物活性分析与天然ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ对照品完全一致。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析

采用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增得到人胰岛素样生长因子 1 (IGF 1 )cDNA ,利用基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3 .1 ( +)真核表达载体上 ,成功构建了 pcDNA/I重组表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。MTT法检测结果表明 :重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增生。将重组质粒通过脂质体介导 ,体外转染至人肾细胞 2 93细胞系进行表达 ,经G41 8筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆 ,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。此结果为研究IGF 1对血管内皮细胞作用的分子机制 ,以及利用IGF 1基因治疗肢体及冠状动脉缺血性疾病等的研究奠定了实验基础。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及 …

用ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲ１双酶酶切经改造的ＰＵＣ－ａＦＧＦ质粒,获得了人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａＦＧＦ）基因,将该基因片段插入表达载体ｐｄｄ２２３－３,筛选得到了重组质料,ｐｋｋ－ｈａＦＧＦ,加ＩＰＴＧ诱导该粒质转化的大肠杆菌ＪＭ１０９表达,ｈａＦＧＦ在发酵液中的表达水平约８９ｍｇ／Ｌ。用肝素亲和层析的方法,获得了电沪纯ｈａＦＧＦ样品。纯化过程中ｈａＦＧＦＧ活力回收率６５％。纯化ｈａＦＧＦ样品的     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的 建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响.方法 双酶切质粒pXT1 -X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

人P选择素胞外区Lectin-EGF片段的基因克隆及表达研究

目的 构建表达人P-选择素胞外凝集素-表皮生长因子样区(Lectin—EGF)片段的基因工程菌。方法 从人血小板中提取总RNA，经RT—PCR得到P-选择素cDNA，用PCR方法扩增其中的Lectin—EGF片段，并将其克隆到原核表达载体PBV220中，再转化宿主菌DH5α。结果 通过酶切、PCR和基因序列分析确定重组载体片段为目的基因的核苷酸序列，并在大肠杆菌中获有效表达重组蛋白。结论 表达人P-选择素胞外区Lectin—EGF片段的基因工程菌的成功构建，为在大肠杆菌中大量表达该表位片段对应蛋白从而制备其抗体提供基础。     

小鼠胰岛素样生长因子-1基因体外克隆及表达的研究

目的 探讨小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因提取、鉴定及重组质粒转染COS-7细胞表达.方法 通过RT-PCR获取小鼠骨骼肌IGF-1的cDNA,将该基因亚克隆入重组质粒p1 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP)中,构建重组质粒p2 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP- IGF-1),脂质体转染COS-7细胞,ELISA检测细胞培养基中IGF-1蛋白量.结果 克隆IGF-1基因cDNA与GenBank中该基因序列一致,重组质粒转染COS-7细胞培养基中均含有IGF-1蛋白.结论 IGF-1基因成功构建到重组质粒p2中,且能在COS-7细胞中过表达.     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达

目的构建人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）基因，并表达GST一^2Gly-hGLP-1。方法用限制性内切酶双酶切载有hGLP cDNA的重组克隆质粒PMD18T simple和原核表达质粒pGEX-4T-1，将GLP-1定向插入原核表达载体pGEX-4T-1^＊中，筛选出阳性克隆。在获得重组hGLP-1基因工程菌的基础上，利用定向突变的技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸，经酶切克隆于pGEX-4T-1^＊中，构建pGEX-4T-1^＊／^2Gly-hGLP-1表达载体。转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果经测序分析，证明^2Gly-hGLP-1已经克隆到pGEX-4T-1^＊中。Western blot证实，该蛋白可被特异性hGLP-1识别。结论成功构建和表达了人胰高血糖素样肽-1突变体原核表达质粒。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

人腺病毒五邻体基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得腺病毒五邻体基因的完整序列,将此片段定向克隆到pQE30载体的多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用酶切鉴定方法与核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 用PCR法获得了人腺病毒的五邻体基因,将该基因正确地重组到表达质粒pQE30中,构建出腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.结论 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.