体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。 目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。 方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。 结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

人参皂苷Rg1诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用

目的研究人参皂苷Rg1在体外能否诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,人参皂苷Rg1诱导分化,光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,RT-PCR检测细胞NGF mRNA的表达。结果大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可以在体外大量扩增。人参皂苷Rg1诱导72h后,部分骨髓间充质干细胞（35．57％±3．59％）转变为神经元样细胞,免疫细胞化学染色NSE呈阳性,分化的神经元样细胞可能表达NGF mRNA。结论人参皂苷Rg1可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,并且可能表达NGF mRNA。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化☆

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。 目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。 方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。 结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

急性肝衰竭大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景：研究发现肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4和表皮细胞生长因子等可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,关于肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用尚未见报道。 目的：观察急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。 方法：采用密度梯度离心法从SD大乳鼠股骨、胫骨分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。采用急性肝衰竭大鼠血清诱导培养骨髓间充质干细胞,以常规培养液诱导为对照,观察细胞形态的变化,诱导培养14 d采用免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白、白蛋白的表达。 结果与结论：急性肝衰竭大鼠血清诱导培养14 d, 可见骨髓间充质干细胞发生明显的形态学改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,甲胎蛋白和白蛋白表达阳性率分别为(54.8±7.64)%和(45.9±9.68)%;对照组细胞未发生形态学改变,无甲胎蛋白和白蛋白的表达。证明了急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景：文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见。 目的：建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 方法：密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。 结果与结论：分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%。结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化：肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用*

背景：研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟。 目的：探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性。 方法：取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20 μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20 μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14 d RT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达。 结果与结论：人骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44。肝细胞生长因子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白 mRNA均呈阳性表达;空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白 mRNA均呈阴性表达。证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景：体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用。关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道。 目的：进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。 方法：采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养;传2代后,用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10％胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化。倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素。 结果与结论：第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化**

背景：非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位，并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，表现出一定的多分化潜能。 目的：探讨表皮生长因子对非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落的影响，及其在体外向神经细胞分化的能力。 方法：分离小鼠双侧股骨、胫骨，全骨髓法分离总骨髓细胞，采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法纯化非黏附骨髓间充质干细胞。取第5代总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞诱导液培养2周。观察非黏附骨髓细胞产生成纤维细胞集落形成单位的能力，表皮生长因子对成纤维细胞集落形成单位的影响，甲苯胺蓝和免疫细胞化学染色鉴定相关蛋白的表达。 结果与结论：总骨髓细胞、反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位。给予表皮生长因子处理后，非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位的效率明显增高。诱导2周后，免疫细胞化学染色显示，总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞均表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200；经甲苯胺蓝染色在部分细胞中可见神经元特异性标记尼氏体。证实表皮生长因子可有效促进小鼠非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落形成单位的效率，经反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞能够诱导分化为神经细胞。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景: 黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为 神经退行性疾病的治疗提供新的方式。 目的：探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点。 设计：细胞学体外观察。 材料：清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108 L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片。盖玻片上细胞达80%~90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接。免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多。 结论：黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化。 关键词：黄芪;骨髓间充质干细胞;神经干细胞;诱导分化     

细胞因子联合纹状体条件培养液定向诱导间充质干细胞体外分化为多巴胺能神经元

背景：在众多体外诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化研究中，诱导阳性率仍不理想。 目的：实验应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元，拟探讨提高诱导阳性率的方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象的对照观察细胞学实验，于2006-07/2007-12在山东大学齐鲁儿童医院和山东大学第二医院血液实验室完成。 材料：健康成年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离，新生Wistar大鼠用于纹状体条件培养液的制备。 方法：采用贴壁法分离纯化健康成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养。取出生24 h内新生Wistar大鼠，完整剥离其大脑组织制备纹状体条件培养液。取体外培养的第5代间充质干细胞，用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的预诱导液进行预诱导，24 h后去除预诱导液，换用纹状体条件培养液进行诱导。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态变化，并应用细胞免疫化学技术检测细胞内神经元特异烯醇化酶和酪氨酸羟化酶表达。 结果：大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液诱导后细胞胞体逐渐回缩成团，形成梭形，部分细胞可见突起伸出，类似神经元。细胞免疫化学检测，诱导后细胞神经元特异烯醇化酶阳性表达率为( 72.70±14.81)%，酪氨酸羟化酶阳性表达率为(34.50±15.93)%。 结论：应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合纹状体条件培养液诱导分化体系，获得了高比例的神经元，其中包括较多的多巴胺能神经元。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化：超顺磁性氧化铁颗粒的标记

背景：骨髓间充质干细胞体外经多种诱导剂均可成功转化为心肌样细胞,目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮胞苷。超顺磁性氧化铁颗粒直径小,可被干细胞吞噬,加上其顺磁性可被MRI探测到信号,因而成为目前广泛应用于活体检测干细胞移植的理想示踪剂。 目的：与未经标记的干细胞相比,观察超顺磁性氧化铁颗粒标记方式对干细胞体外经5-氮胞苷诱导向心肌样细胞分化效应的影响。 方法：分离培养猪骨髓间充质干细胞,实验组采用P3代细胞经超顺磁性氧化铁颗粒标记,标记后细胞经5-氮胞苷体外诱导24 h后继续培养,对照组直接经5-氮胞苷诱导。2周后用抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白43进行免疫细胞化学染色鉴定,经普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒。 结果与结论：5-氮胞苷诱导分化后细胞表达抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I和连接蛋白43,且超顺磁性氧化铁颗粒标记诱导细胞内普鲁士蓝染色呈阳性。提示超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导后可以分化为心肌样细胞。     

Neural cell co-culture induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neuronal-like cells★

BACKGROUND: It has been previously demonstrated that the neural cell microenvironment has the ability to induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into the neural cells. OBJECTIVE: To establish a co-culture system of human BMSCs and neural cells, and to observe effects of this co-culture system on differentiation of human BMSCs into neural cells. DESIGN, TIME AND SETTING: A comparative observation experiment, performed at the Center Labora-tory of the Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University from October 2006 to December 2007. MATERIALS: Neural cells were obtained from human fetal brain tissue. BMSCs were harvested from fe-male patients that underwent autonomous stem cell transplantation. METHODS: BMSCs in the co-culture group consisted of BMSCs and third passage neural cells. BMSCs in the control group were solely cultured in vitro. MAIN OUTCOME MEASURES: Morphological changes of BMSCs were observed, and expression of the neuronal specific marker, neuron-specific enolase (NSE), was analyzed by immunofluorescence staining after 4–5-day co-culture. RESULTS: The number of neural cells in the co-culture group increased and the cells spread on the culture bottle surface. Radial dendrite formed and connected with each other. NSE-immunoreactive cells were also detected. The positive ratio of NSE-positive cells reached (32.7±11.5)%, with morphological characteristics similar to neuronal cells. Human BMSCs did not express NSE in the control group. CONCLUSION: The microenvironment provided by neurons induced differentiation of BMSCs into neu-ronal-like cells. Key Words: bone marrow mesenchymal stem cells; stem cell transplantation; cell differentiation; neurons     

黄芪和三七对下肢缺血患者骨髓间充质干细胞体外分化的影响

背景：目前临床观察已经证实中药黄芪、三七能够改善下肢缺血症状，假设这种治疗作用与其促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化有关。 目的：验证黄芪、三七是否能够有效促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化。 设计、时间及地点：骨髓间充质干细胞的体外分化实验，于2005-04/06在北京中医药大学附属东直门医院教育部重点实验室完成。 材料：抽取北京中医药大学东直门医院收治的下肢血管缺血性病变患者23例骨髓血，密度梯度法分离骨髓单个核细胞，即骨髓间充质干细胞。相当于生药材2 g/mL的黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂产品，主要成分为三七总皂苷的血塞通粉针剂黑龙江珍宝岛制药有限公司产品，CD34抗体为美国BD 公司产品，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。 方法：将骨髓间充质干细胞与3 mL低、中、高剂量含生药4，12，36 g/L的黄芪注射液，3 mL低、中、高剂量含三七总皂苷50，100，200 mg/L血塞通混悬液进行共培养，并设未加入药物的单纯培养干细胞为空白对照组；隔日换液一次, 连续培养3周。 主要观察指标：培养3周后, 倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测CD34+细胞百分比。 结果：①骨髓间充质干细胞培养3周后贴壁细胞大部分呈梭形, 束状排列,具有内皮细胞形态和特性。②与空白对照组比较，黄芪低、中剂量组和三七中、高剂量组CD34+细胞百分比显著增加(P < 0.05~0.01)。 结论：黄芪、三七有促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化的作用，此作用呈剂量依赖性。     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景：如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题。 目的：实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成。 材料：普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养。 方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化。诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强。诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇。换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞。骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元。 结论：甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的分化☆

背景：特定环境下体外可定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞分化。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为甲状腺细胞的实验方法。 方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素和胰岛素诱导,以未诱导组为平行对照。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达,第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达;对照组未见变化。形态学与生物学证实了骨髓间充质干细胞可诱导培养为甲状腺细胞。     

依达拉奉体外定向诱导人间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：依达拉奉作为新型氧自由基清除剂,一般用于抑制脂质过氧化反应,减轻脑水肿,保护神经细胞。 目的：观察依达拉奉体外定向诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-09广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于创伤所致闭合性股骨骨折的成年患者,由广东医学院附属医院骨科提供。依达拉奉由南京先声药业生产,批号P2007123144254453。 方法：无菌抽取的骨髓经肝素化后,采用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离获得人骨髓间充质干细胞,传至第5代按1× 108 L-1接种于6孔板内,设立2组,依达拉奉组细胞达50%融合时用含碱性成纤维生长因子、胎牛血清的L-DMEM预诱导24 h,PBS洗涤后再用20 mg/L依达拉奉无血清L-DMEM诱导24 h;空白对照组始终用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养,不加任何预诱导剂和诱导剂。 主要观察指标：诱导分化后细胞形态变化,SP法免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白2的表达。 结果：体外诱导1 h后,依达拉奉组胞体收缩,2 h后形成较长突起,5 h后呈典型神经元样细胞;空白对照组细胞仍呈对称的梭形,无突起形成。免疫组化结果显示,诱导6 h后依达拉奉组神经元样细胞的胞体及部分突起呈棕黄色,强表达神经元烯醇化酶,弱表达胶质纤维酸性蛋白和巢蛋白,不表达微管相关蛋白2;空白对照组上述4种特异性抗原均呈阴性表达。 结论：人骨髓间充质干细胞经依达拉奉体外诱导后,所分化的细胞具有神经元表型,但还不够成熟,处于向成熟神经元分化的中间阶段。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景：心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建。 目的：建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。 方法：全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测。 结果与结论：骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点。提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异,以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法取昆明小鼠双股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增BMSCs,流式细胞术检测其表面标志物,并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞,比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠BMSCs,随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs,而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1,而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支;化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起,形成神经样结构。结论采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs,通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。