小鼠前脑线粒体蛋白的增龄性变化

目的　探讨小鼠前脑不同发育阶段线粒体蛋白的表达变化。 方法　分别取妊娠12.5 d（E12.5）及17.5 d（E17.5）的胎鼠、出生2 d的新生鼠、出生3周的幼鼠和2月龄成年鼠的前脑组织,利用QRT-PCR和Western blotting检测小鼠前脑发育不同阶段中COX IV、HSP60、OGDH、PDHE1α的mRNA和蛋白表达水平。 结果　在E12.5 ~2 d的前脑组织中COX IV mRNA呈低水平表达,3周时表达量明显升高并达到顶峰;HSP60和PDHE1α mRNA在E17.5表达明显增高,OGDH mRNA则在2 d显著上升,三者表达水平均于2月达到顶峰。COX IV、HSP60、OGDH的蛋白水平从E12.5 ~3周无明显差异,但在2月时表达显著上升;PDHE1α蛋白随前脑发育其表达水平不断提高,并于2月达到高峰。此外,COX IV、HSP60、OGDH、PDHE1α mRNA与蛋白表达水平呈正相关。 结论　COX IV、HSP60、OGDH和PDHE1α可能参与了小鼠前脑发育过程且与年龄密切相关。     

局灶性脑缺血对内源性神经干及前体细胞增殖、分化和迁移的影响

背景：正常成年动物中枢神经系统内存在能增殖、多向分化潜能的神经干细胞或神经前体细胞。在生理情况下，这些内源性神经干细胞或前体细胞处于静息状态。当脑缺血时，这些细胞将处于何种状态?目的：研究大鼠局灶性脑缺血时，内源性神经干细胞的分布、增殖、分化。设计：以大鼠为研究对象，随机对照的探索性研究。单位：一所医学院的神经生物学研究室、组织胚胎学教研室。材料：实验于2001—07／2002-07在泸州医学院神经生物学研究室完成。选择健康成年SD大鼠41只，雌雄不限，体质量250-300g。干预：阻塞大鼠大脑中动脉2h再灌流0．5，3，6，12h，1，2，3，5，10d制成局灶性脑缺血模型，阻塞线不能阻塞大脑中动脉为假手术组，正常大鼠为对照组。在各时间点处死动物，制成脑组织切片，用免疫组织化学单标和双标观察内源性神经干细胞或前体细胞的增殖、分布、分化。主要观察指标：内源性神经干／前体细胞的分布、分化。结果：在正常组和假手术组多数脑室室管膜细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性，脑实质内有零星散在增殖性细胞核抗原阳性细胞。再灌流3h，增殖性细胞核抗原阳性细胞出现在嘴侧脑室下层。再灌流12h以后，双侧侧脑室的一些脉络膜丛细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性。再灌流3-10d，视前区梗死区周边、纹状体、额顶皮质的增殖性细胞核抗原免疫反应阳性细胞显增加。再灌流3d，增殖性细胞核抗原阳性细胞开始出现于海马齿状回的颗粒下层，并随再灌流时间延长，增殖性细胞核抗原阳性细胞数量增多。免疫组化双标显示再灌流3d视前区有很少量的增殖性细胞核抗原／胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞，随后增多。再灌流10d内，未检查到增殖性细胞核抗原／神经丝双标阳性细胞。结论：脑缺血时诱导内源性神经干细胞增殖、分化，并向缺血纹状体和皮质迁移，此现象有助于阐明神经功能康复的机制。     

脑出血后大鼠神经干细胞增殖及迁徙途径的实验研究

目的探讨脑出血后大鼠神经干细胞增殖变化及迁徙途径。方法将75只SD大鼠随机分为脑出血组、假手术组和正常组,脑出血组采用自体血注入法复制脑出血模型。各实验大鼠腹腔注射溴脱氧核苷尿嘧啶(Brd U)标记神经干细胞,运用免疫组化染色观察神经干细胞增殖及迁徙分布情况。结果脑出血组侧脑室下区室管膜上皮的Brd U阳性细胞数比假手术组和正常组显著增加(P<0.05),Brd U阳性细胞沿胼胝体迁徙,最后散在分布于出血灶及周边区。结论脑出血后神经干细胞可增殖并沿胼胝体向出血灶及周边区迁徙,参与出血性脑损伤神经功能的修复。     

胃癌患者血清IL-6、IL-8及IL-10的表达及意义

应用ELISA 法检测45例胃癌患者(胃癌组)血清IL-6、IL-8及IL-10水平,并与19例胃良性肿瘤患者(肿瘤组)及20例健康人(对照组)比较.结果 胃癌组上述细胞因子表达水平均明显高于对照组和肿瘤组(P均＜0.01),胃癌浸润肌层者高于浸润黏膜层者,有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者,Ⅲ～Ⅳ期者明显高于Ⅰ～Ⅱ期者(P均＜0.01).认为IL-6、IL-8及IL-10参与了胃癌的发生、发展;检测其血清含量对了解胃癌患者免疫状态和判断病情及预后有重要意义.     

绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达

目的 探讨利用绿色荧光蛋白(GFP)作为骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑出血示踪标记物的可行性.方法 利用GFP空载体重组腺病毒感染BMSCs,应用脑立体定位仪将感染的BMSCs移植入脑出血大鼠纹状体内,移植后5、14 d,脑组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察BMSCs在脑组织内分布的表达.结果 感染细胞与未感染细胞体外培养形态无差异,感染细胞及其传代细胞发强绿色荧光.荧光显微镜下观察脑出血模型冰冻切片,移植后各时间点在移植部位周围病灶区内有大量发绿色荧光的细胞.结论 GFP感染BMSCs能在脑出血大鼠脑内稳定持久表达,表明GFP是脑出血干细胞移植治疗的有效示踪标记物,为进一步研究移植细胞在宿主脑内的可塑性研究奠定基础.     

波形蛋白与DNA拓扑异构酶Ⅱ在病理性瘢痕中的表达及意义

目的:比较波形蛋白及DNA拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)、β(TopoⅡβ)在病理性瘢痕、成熟瘢痕和正常皮肤中的表达情况,探讨它们与成纤维细胞生物学特征的关系及在瘢痕形成中的作用.方法:应用免疫组织化学检测病理性瘢痕、成熟瘢痕和正常皮肤各10例,了解其中波形蛋白、TopoⅡα、β的表达水平,测定光密度值,并分析其相关性.结果:波形蛋白在病理性瘢痕和成熟瘢痕真皮层大量表达;TopoⅡα蛋白在病理性瘢痕表皮基底层表达明显低于正常皮肤和成熟瘢痕,但是在真皮层血管周围有阳性表达;TopoⅡβ蛋白在病理性瘢痕表皮层表达明显低于正常皮肤和成熟瘢痕,但是在真皮层胶原纤维增生区域大量表达.各组光密度值差异有统计学意义.结论:TopoⅡα、β在病理性瘢痕真皮层表达增强,与波形蛋白的表达一致,提示其可能与病理性瘢痕的形成有关.     

移植GDNF基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用

目的:探讨移植胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的神经干细胞(NSCs)是否比单纯NSCs移植对脑卒中有更好的神经保护.方法:用GDNF重组质粒转染NSCs,构建过表达GDNF的NSCs(GDNF/NSCs).插线法制备大鼠脑缺血卒中模型,再灌注3d,脑立体定位分别移植NSCs、 GDNF/NSCs以及生理盐水到同侧侧脑室,实验分为GDNF/NSCs组、NSCs组和对照组.再灌注第1、 2、 3、 5和7周处死大鼠,用改良的神经功能缺失评分和H-E染色分别评估大鼠神经功能和脑梗死体积;免疫组织化学显色观察移植的NSCs数量与分布和突触蛋白Syn、 PSD-95在脑组织的表达.结果:再灌注2、 3周,GDNF/NSCs组较NSCs组神经功能恢复更好.在各时间点GDNF/NSCs和NSCs组大鼠脑缺血体积较对照组显著减小;GDNF/NSCs组的NSCs细胞数量较NSCs组显著增多.再灌注2和3周,GDNF/NSCs组Syn免疫阳性产物比NSCs组显著增加;各时间点GDNF/NSCs组的PSD-95免疫阳性产物比NSCs组显著增加.结论:GDNF基因修饰的NSCs比NSCs对大鼠脑卒中有更好的神经保护作用.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达

背景：以往对脑缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3,Caspase-3)的表达均缺乏长时间的动态观察。 目的：探讨胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植对暂时性脑缺血大鼠脑组织Caspase-3表达的影响。 设计：随机对照动物实验。 材料：清洁级成年SD大鼠60只,随机分为4组：正常对照组5只、缺血再灌注组5只、单纯细胞移植组25只、基因修饰细胞移植组25只。另取清洁级新生SD大鼠数只,用于分离培养神经干细胞。 方法：除正常对照组外,其余3组大鼠按改良性线栓法制备暂时性脑缺血模型。再灌注3 d,单纯细胞移植组从右侧侧脑室每只注入20 μL神经干细胞悬液,含(4.0~5.0)×105个神经干细胞;基因修饰细胞移植组每只注入等量胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞悬液;缺血再灌注组每只注入20 μL生理盐水。正常对照组、缺血再灌注组在缺血再灌注1周麻醉处死动物,单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组分别在缺血再灌注1,2,3,5,7周麻醉处死动物,5只/时间点。 主要观察指标：采用免疫组织化学SP法观察Caspase-3在海马和额顶皮质表达及分布特点。 结果：免疫组织化学染色显示,Caspase-3免疫阳性产物位于细胞核、细胞质和部分突起。在海马：单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P < 0.05)。在额顶皮质：单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数亦均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1,2周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P < 0.05)。 结论：胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植通过降低Caspase-3的表达,减少神经元凋亡,从而抑制缺血性脑损伤的进行性恶化,其移植效果优于单纯神经干细胞移植。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞.方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行.①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处胃符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔.采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化.③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学榆测神经细胞特异性标志的表达.结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种l d后开始贴壁增殖,3 d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10 d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7 d左右达到融合.②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中.将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞.③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞:从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性.结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞移植脑出血大鼠神经营养因子的表达

背景:研究证实,细胞移植和神经营养因子相结合治疗脑损伤能促进大鼠神经功能的恢复。目的:观察移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞对大鼠脑出血后神经营养因子表达的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型鼠随机分为3组,骨髓基质干细胞组、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组和对照组于建模后第3天在脑出血部位分别移植骨髓基质干细胞、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞以及生理盐水。结果与结论:与对照组和骨髓基质干细胞组相比,胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组大鼠神经功能恢复更好;与对照组相比,移植后1,2周其他2组各神经营养因子表达均显著增加(P<0.05)。提示胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗脑出血大鼠比单纯骨髓基质干细胞有更好的神经保护作用。