中国红树类海桑属植物DNA条形码研究＊

目的 对中国的6种红树类海桑属植物进行DNA条形码研究，为该属植物鉴定、资源保护、合理开发等提供参考依据。方法 以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码，对分布在中国的海桑属植物进行基因组DNA提取、PCR扩增和双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接获得叶绿体psbA-trnH基因间区序列和核ITS2序列，用软件MEGA6.0进行相关数据分析，构建NJ（邻接）树。结果 我国6种红树类海桑属植物的ITS2序列间存在明显差异，psbA-trnH序列间也存在一定的碱基差异，表明6种海桑属植物具有其各自独特的DNA条形码，可以相互区别，同时基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接（NJ）树可以看出6种海桑属植物具有或近或远的亲缘关系。结论 核ITS2和叶绿体psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别我国6种红树类海桑属植物，为后续药用资源开发等相关研究提供了参考。     

基于DNA条形码技术鉴别4种龙胆科"地格达"类蒙药基原植物

目的:建立一种快速、准确和标准化的龙胆科“地格达”类蒙药材的DNA条形码鉴别方法,为“地格达”类蒙药材的分子鉴定提供依据.方法:对蒙药地格达类药用植物进行通用引物PCR扩增,PCR扩增产物直接测序,并对序列进行分析.结果:测得4种“地格达”的rbcL,ITS,trnH-psbA和matK全长序列,4种序列长度的范围为388 -940 bp,rbcL,ITS,matK序列都可以将其鉴别出来.结论:tmH-psbA序列不适合用于4种“地格达”的鉴别,ITS序列可作为地格达类蒙药材一种良好的分子标记.通过DNA条形码鉴别方法可对4种龙胆科“地格达”进行准确、可靠、有效的分子鉴别.     

基于谱学技术鉴别4种龙胆科“地格达”类蒙药材

为探讨谱学技术在龙胆科“地格达”类蒙药材鉴别中的应用,分别采用近红外光谱分析和差示扫描量热分析技术对4种龙胆科“地格达”类蒙药材进行研究,并对得到的特征图谱进行系统分析。在近红外一维图谱4 250~4 400,5 650~5 800 cm^-1四者存在一定差异,在二阶导数图谱4 100~4 400,4 401~4 900,5 400~5 800 cm^-1四者呈现显著差异;并且四者的DSC曲线具有明显不同的拓扑图形、特征峰及峰顶温度。通过近红外光谱分析和差示扫描量热分析2种谱学技术可实现4种龙胆科“地格达”类蒙药材的高效、准确鉴别,为龙胆科“地格达”类蒙药材的快速鉴别提供科学依据。     

基于超快速VPCR荧光可视化检测技术的小檗皮及其藏成药中原料药的真伪鉴别研究

目的 建立藏药小檗皮BerberisCortex及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速荧光可视化检测方法,实现对小檗皮药材及藏成药中小檗皮的快速鉴别。方法 将小檗皮及其混淆品的ITS2序列进行比对,筛选出小檗皮药材特异性DNA序列;针对该序列设计小檗皮特异性引物,建立小檗皮药材以及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速VPCR扩增体系;后将该扩增体系与SYBR Green I荧光染料相结合,实现对扩增产物的荧光可视化检测;同时对该体系的特异性、灵敏度以及在真实样本中的适用性进行考察。结果 该体系可以在40min内完成对小檗皮以及藏成药中小檗皮特异性DNA的扩增及荧光可视化检测;检测限低至10pg/μL;对16个批次的小檗皮药材进行分析,其中15个批次的样本产生阳性信号鉴定为小檗皮,与测序结果 100%一致,1个批次的样本产生阴性信号,该样本经通用引物测序鉴定为黄柏;对3种含有小檗皮的藏成药进行分析,3个样本均产生阳性信号。结论 所建方法缩短了检测时间,并且特异性良好,灵敏度高,可以对小檗皮及其藏成药中小檗皮进行快速、准确的可视化鉴别。     

17种毛茛科藏药材的分子鉴别＊

目的 毛茛科的多种植物是民族药的基原，本研究以ITS2序列作为DNA条形码对17种毛茛科藏药材进行鉴定，为药材的安全使用提供可靠的检测方法。方法 从四个省份采集或购买17种毛茛科藏药材样本，分布于8个属。采用试剂盒法提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列后，将扩增产物进行双向测序。利用CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件进行序列拼接，将拼接后的序列在NCBI网站进行在线比对。在GenBank数据库中下载相关物种的rDNA序列（包含完整的ITS2区域）。上述序列经过CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件剪切后，采用BLAST方法进行比对，然后再采用两种评估ITS2序列的鉴定能力。第一种是系统聚类树法（Tree-based method），用MEGA（v.5.0）软件构建NJ系统聚类树（Neighbour-Joining tree）；第二种是遗传距离法（Distance-based method），用TaxonGap（v.2.4.1）软件分析物种的种内与种间变异关系。结果 29份试验样本的ITS2序列测序成功率为100%，与93条数据库中下载的ITS2序列合并后，长度为213-230 bp，比对长度为244 bp，变异位点数72.1%。BLAST结果表明，29条ITS2序列可以将全部物种鉴定到属。系统聚类分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别8个物种；遗传距离分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别7种毛茛科药材。两种方法总共可以鉴别9种药材，它们是露蕊乌头（Aconitum gymnandrum）、草玉梅（Anemone rivularis）、多小叶升麻（Cimicifuga foetida var. foliolosa）、短尾铁线莲（Clematis brevicaudata）、长花铁线莲（Clematis rehderiana）、甘青铁线莲（Clematis tangutica）、腺毛黑种草（Nigella glandulifera）、拟耧斗菜（Paraquilegia microphylla）和芸香叶唐松草（Thalictrum rutifolium），鉴定效率为52.9%。结论 ITS2序列可以快速、准确地识别和鉴定部分毛茛科藏药材，为原植物和药材的分子鉴定提供依据。     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。     

白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究

 目的 建立一种基于特异性聚合酶链式反应(PCR)及荧光染料检测快速鉴别西红花真伪品的方法。方法 通过对叶绿体基因片段测序和比对分析,找出西红花与其常见掺伪品序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建并优化聚合酶链式反应扩增反应体系,使用荧光染料法检测聚合酶链式反应产物,实现西红花的快速鉴别。结果 建立了基于psbA-trnH序列的西红花鉴别体系,优化后的聚合酶链式反应反应条件为90 ℃预变性1 min,90 ℃变性5 s,58 ℃延伸5 s,26个循环。在聚合酶链式反应反应产物中加入染料SYBR Green I,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光。结论 位点特异性聚合酶链式反应方法可以简单快速鉴别西红花及其掺伪品。     

蒙药地格达-8味散方源、方解、临床应用考证

地格达-8味散收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：蒙药》（1998年版）是由地格达（即肋柱花）、木鳖子（制）、麦冬、木香、山苦荬、角茴香、胡黄连、黄柏等组成的热性希拉病主方。本文通过查阅历代本草、医籍、方书、经史等文献,对地格达-8味散进行了系统的方源、方解、临床应用考证。本次考证为该药推广及开发利用奠定研究基础。     

基于位点特异性PCR的黄芪与红芪鉴别方法研究

研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份,所有样品进行总DNA的提取,通过对黄芪及红芪药材trnL-trnF片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现黄芪可扩增出136 bp 片段,红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究

完善快速PCR鉴定检测体系,并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法。收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料,所有样品进行总DNA的提取,通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,采用2步法进行PCR扩增,从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别。通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序。在稀释后的PCR产物中加入SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光,且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题。快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。     

基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法,采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉,13份锁阳以及8份黄花列当,所有样品进行总DNA提取,通过对其ITS片段进行扩增,测序。再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化;另外,对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。结果显示,该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中,荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带,而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带,从而实现了正伪品的鉴别。该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。     

基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究

该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选最适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物psb A-trn H,ITS,trn L-trn F,mat K,rbc L序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psb A-trn H荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明,通过psb A-trn H荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材。研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。     

基于ITS2序列SNP位点鉴定白及药材及其混伪品

为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增rDNA ITS2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点。结果显示,ITS2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点。针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412R,HHBJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生。该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法。     

快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30~45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。     

含灯盏花中成药DNA提取及其分子鉴定

目的:优选适用于含灯盏花中成药的DNA提取方法和聚合酶链式反应(PCR)扩增引物,并通过测序和系统发育分析实现对其原料灯盏花的分子鉴定。方法:采用4种十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)改良方法对3种含灯盏花的中成药进行DNA提取,测定DNA的纯度和浓度。采用内转录间隔区(ITS)、matK、psbA-trnH、rbcL位点通用引物对提取的中成药DNA进行PCR扩增,并对PCR扩增最佳位点进行测序,通过构建系统发育树进行分子鉴定。结果:4种CTAB改良方法均能获得含灯盏花中成药DNA,其中CTAB改良方法一提取的DNA质量浓度显著高于其他改良方法;PCR扩增中以matK位点2对引物(matKXF/matK5R或matK3F/matK1R)最佳,可通过1次PCR成功获得具有单一条带且浓度较高的PCR产物,序列与灯盏花对照药材同源性为100%,系统发育树显示可与同属其他植物区分。结论:通过CTAB改良方法一可以有效提取含灯盏花中成药样品的DNA,采用matK位点引物matKXF/matK5R或matK3F/matK1R进行1次PCR扩增并对产物进行测序,通过序列比对可完成其原料灯盏花的鉴定。     

高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

 目的建立一种简便、准确的乌梢蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法根据乌梢蛇及10种常见混淆品线粒体12SrRNA基因序列,设计一对专用于乌梢蛇的鉴别引物HWL-1和HWH-1,用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场上购买的各种乌梢蛇药材。结果PCR结果是在65℃复性温度下,正品乌梢蛇得到约320 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。为检验该方法的准确性,对市售乌梢蛇炮制品随机选取13块进行PCR鉴别验证,其中正品9块,混淆品4块,检出率达100%。结论所设计的鉴别引物对正品乌梢蛇有高度的特异性。PCR方法稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果无影响。本方法简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好。