金黄色葡萄球菌锰超氧化物歧化酶的表达纯化及活性分析

目的克隆表达、纯化金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)并测定其活性。方法使用Clustal Omega比对不同来源Mn-SOD的序列,使用Swiss model网站预测金黄色葡萄球菌Mn-SOD的三级结构。提取细菌DNA,以此为模板PCR扩增获得Mn-SOD基因并将其与pET28a连接,构建pET28a-Mn-SOD重组质粒。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)获得重组菌BL/pET28a-Mn-SOD,使用IPTG诱导表达重组Mn-SOD,通过镍柱亲和层析纯化Mn-SOD蛋白并测定不同pH条件下的酶活性。结果金黄色葡萄球菌Mn-SOD具有Mn-SOD的特征序列和锰离子结合位点。成功得到重组质粒pET28a-Mn-SOD,转化大肠埃希菌BL21后表达相对分子质量为24.8×10^3的Mn-SOD,使用Ni^2+柱纯化后得到高纯度的Mn-SOD,且在pH值为7.5时活性较高,约为3 200 U/mL。结论成功构建了pET28a-Mn-SOD重组质粒能,表达的Mn-SOD重组蛋白纯化后仍具有SOD活性。     

弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。     

白色念珠菌谷氧还蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的纯化白色念株菌(Candida albicans)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)并制备多克隆抗体。方法从NCBI网站搜索白色念株菌Grx蛋白序列,采用利用生物信息学方法分析其生物学特性。以白色念珠菌DNA为模板,PCR扩增Grx基因,双切后与质粒pET28a相连,连接产物pET28a-Grx转入表达菌BL21(DE3),使用IPTG诱导目的蛋白表达,使用亲和层析纯化目的蛋白。用Grx蛋白免疫小鼠,制备抗血清,进行Western blot和ELISA检测。结果白色念珠菌Grx蛋白含有一个CXXC结构域,属跨膜蛋白。其二级结构中58.8%的氨基酸为α-螺旋,12.6%为β片层,23.5%为无规卷曲,三级结构与酵母Grx蛋白结构相似。Grx蛋白具有多个B细胞表位。获得Grx基因并成功构建重组质粒pET28a-Grx,转染DE3后表达15.2×103的重组蛋白。用纯化的重组Grx蛋白免疫小鼠,获得的多克隆抗体ELISA效价为1:10 240。结论成功表达白色念株菌Grx蛋白并制备了高滴度的多克隆抗体,为Grx的活性研究奠定了实验基础。     

肺炎克雷伯菌烷基过氧化氢还原酶C的表达纯化及其活性测定

目的表达、纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C,Ahpc)并测定其活性。方法利用Clustal Omega分析不同细菌Ahpc蛋白的同源性;利用生物信息学方法分析肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白的生物学特性。根据Ahpc基因,设计PCR引物,以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,PCR扩增Ahpc基因,双酶切后将其连接到pET28a,获得重组质粒pET28a-Ahpc。将重组质粒转化大肠埃希菌,使用IPTG诱导重组Ahpc蛋白的表达,使用亲和层析纯化目蛋白,采用氧化铁二甲酚橙法测定Ahpc蛋白降解叔丁基过氧化氢活性。结果肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白含有两个半胱氨酸的经典过氧氧化还原蛋白,定位在细菌细胞质,无跨膜结构域。其α螺旋、β片层以及无规卷曲的含量分别为27.8%,19.7%和52.4%。三级结构是由10个同源的Ahpc蛋白组成同源多聚体。Ahpc蛋白具有多个B细胞表位。PCR扩增得到564bp的Ahpc基因,构建的pET28a-Ahpc重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后能表达分子质量单位约为24.7ku的重组Ahpc蛋白。亲和层析法获得纯度较高的重组Ahpc蛋白,纯化的重组蛋白能降解丁基过氧化氢。结论成功表达了肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白,该蛋白纯化后仍具有降解能够降解丁基过氧化氢的活性,为肺炎克雷伯菌的抗氧化机制研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌溶血素共调节蛋白的表达纯化及抗血清的制备北大核心CSCD

目的纯化铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)溶血素共调节蛋白(Hemolysin co-regulated protein,Hcp)并制备抗血清。方法从NCBI网站查到铜绿假单胞菌Hcp蛋白序列,采用Signal IP 4.1预测定位及信号肽情况;登录Swiss model网站预测三级结构情况;登录www.iedb.org网站预测其B细胞表位。根据Hcp基因序列设计特异性引物,以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增Hcp基因,经双酶切后连到pET28a。将重组质粒pET28a-Hcp转化大肠埃希菌BL21(DE3),然后用IPTG诱导重组Hcp蛋白表达。使用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。用Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗血清效价。结果 Hcp定位在细菌细胞浆,无信号肽,6个单体蛋白组成一个环状的中空结构,含有多个B细胞表位。构建的表达质粒pET28a-Hcp能表达23.9×10~3大小的Hcp蛋白,镍柱层析后得到高纯度的Hcp蛋白,重组Hcp蛋白诱导的抗体效价大于1∶10 240。结论成功重组表达铜绿假单胞菌Hcp蛋白及高滴度的抗血清,为研究Hcp的功能奠定了实验基础。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

穿透支原体膜蛋白MYPE2350的表达及免疫活性分析北大核心CSCD

目的对穿透支原体膜蛋白MYPE2350进行生物学信息学分析,构建重组原核表达质粒,表达、纯化并检测该蛋白的免疫学活性。方法从NCBI网站获得穿透支原体特有MYPE2350蛋白的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测和分析MYPE2350蛋白的理化性质、跨膜区、信号肽和B细胞表位等生物学特性。设计引物,PCR扩增MYPE2350基因片段,将其连接到质粒pET28a。将重组质粒pET28a-MYPE2350转化入大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导重组MYPE2350蛋白的表达。分离包含体,使用尿素溶解后利用Ni^(2+)亲和层析法纯化重组MYPE2350蛋白。用重组MYPE2350蛋白免疫小鼠,测定小鼠血清特异IgG含量和IgG2a/IgG1的比值,以及小鼠脾细胞分泌细胞因子的含量。结果 MYPE2350蛋白共有178个氨基酸,相对分子质量为19.4×10^(3),为跨膜蛋白,具有3个跨膜区。该蛋白二级结构中α螺旋占43.82%,β折叠占17.42%,无规卷曲占35.39%,β转角占3.37%。Swiss网站预测的蛋白三级结构的匹配度和可信度不高。MYPE2350蛋白含有多个B细胞表位。构建的重组质粒pET28a-MYPE2350转化BL21后,经IPTG诱导表达重组MYPE2350蛋白,通过亲和层析纯化获得了纯度较高的MYPE2350蛋白。重组MYPE2350蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导小鼠分泌特异性抗体,且IgG2a/IgG1<1。MYPE2350蛋白能诱导小鼠脾细胞IL-4和IL-5(Th2型细胞因子)高表达,但对IFN-γ和TNF-α(Th1型细胞因子)的影响较小。结论克隆表达的重组穿透支原体特有膜蛋白MYPE2350具有良好的免疫原性,能诱导Th2型免疫应答。     

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白4（GRA4）的pET原核细胞表达系统，并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。 方法 利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段，定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a（+），转化大肠埃希菌（E.coli BL21 DE3），以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物，并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其特异性抗体滴度。 结果 成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统，其表达产物相对分子质量（Mr）约为 40 000，主要以包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。 结论 利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白，该蛋白具有一定的免疫学活性。     

日本血吸虫SjGrpE蛋白的表达 纯化 及多克隆抗体制备

目的　分析日本血吸虫核苷酸交换因子（SjGrpE）蛋白生物学特性,表达与纯化重组SjGrpE蛋白并测定其免疫原性。方法　采用生物信息学方法预测SjGrpE蛋白的氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、定位、磷酸化位点、泛素化位点、糖基化位点、二级和三级结构及B细胞表位。以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjGrpE基因,将其双酶切后连接到pET28a载体得到重组质粒pET28a?SjGrpE。将pET28a?SjGrpE转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导目的蛋白表达,并用镍离子亲和层析法纯化蛋白。将重组SjGrpE蛋白免疫小鼠,分离血清并鉴定获得的抗多克隆抗体。结果　 SjGrpE蛋白分子量约为24.3 kDa,是一种亲水性蛋白,无跨膜区、无信号肽,定位在线粒体;该蛋白含有18个磷酸化位点和2个泛素化位点,无糖基化位点,含有5个B细胞表位。SjGrpE基因全长为660 bp,成功构建重组质粒pET28a?SjGrpE并纯化获得重组SjGrpE蛋白。重组SjGrpE蛋白能够刺激小鼠分泌高滴度抗体。结论　成功制备重组SjGrpE蛋白,该蛋白具有良好免疫原性,为后续研究其作为日本血吸虫病疫苗候选分子的价值奠定了基础。     

日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆 表达与功能分析

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白 （SjHMGB1）, 并研究其功能特性。方法 方法 利用逆转录PCR （RT?PCR） 技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段, 然后将其亚克隆至 原核表达载体质粒pET28a （+） 中, 构建重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21 （DE3）, 含 重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层 析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通 过免疫印迹试验 （Western blotting） 和RT?PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjH? MGB1为抗原免疫小鼠, 3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴, 42 d后剖杀, 计算减虫率与减卵率, 观察其诱导抗血 吸虫感染的免疫保护性作用。 结果 结果 采用RT?PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性 DNA条带, 序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a （+） 中, 成功构建 了重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1?pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa 的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1 蛋白可同超螺旋及线性DNA结合, 重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG, Western blotting分析证实重组SjH? MGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别, 表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT?PCR 和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达, 而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验 结果表明, 重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论 结论 获得了编码SjHMGB1基因和 纯化的具有天然功能活性的重组SjHMGB1蛋白; 重组SjHMGB1蛋白具有强烈的免疫原性, 但不能诱导有效的抗血吸虫感 染免疫保护性作用。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

Immunogenicity and immunoprotection of recombinant PEB1 in Campylobacter-jejuni-infected mice

AIM： To construct a prokaryotic expression vector carrying Campylobacterjejuni peblA gene and express it in Escherichia coli. Immunoreactivity and antigenicity of rPEB1 were evaluated. The ability of rPEB1 to induce antibody responses and protective efficacy was identified. METHODS： peblA gene was amplified by PCR, target gene and prokaryotic expression ptasmid pET28a （＋） was digested with BamHI and XhoI, respectively. DNA was ligated with T4 DNA ligase to construct recombinant plasmid pET28a（＋）-peblA. The rPEB1 was expressed in E. coli BL21 （DE3） and identified by SDS-PAGE. BALB/c mice were immunized with rPEBI. ELISA was used to detect the specific antibody titer and MTT method was used to measure the stimulation index of spleen lymphocyte transformation. RESULTS： The recombinant plasmid pET28a （＋）-peblA was correctly constructed. The expression output of PEB1 protein in pET28a （＋）-peblA system was approximately 33% of total proteins in E. coil The specific IgG antibody was detected in serum of BALB/c mice immunized with rPEB1 protein. Effective immunological protection with a lower sickness incidence and mortality was seen in the mice suffering from massive C. jejuni infection. CONCLUSION： rPEB1 protein is a valuable candidate for C. jejuni subunit vaccine.     

寨卡病毒E蛋白及第三结构域的原核表达和多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌中克隆表达和纯化寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)包膜糖蛋白(Envelope Protein,E)及第三结构域(Envelope DomainⅢ,EDⅢ),并制备两种免疫原的鼠多克隆抗体。方法 通过Vero-E6细胞培养扩增ZIKV,提取病毒总RNA并反转录为cDNA,利用E和EDⅢ基因的cDNA序列构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺柱亲和层析法纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清,间接ELISA法测定效价,Western Blot检测特异性。结果 成功表达并纯化重组蛋白E和EDⅢ,获得的多克隆抗体效价均达到1:409 600,Western Blot检测多克隆抗体可特异性识别重组E蛋白和EDⅢ以及天然E蛋白。结论 成功制备出特异性抗寨卡病毒E蛋白和EDⅢ的鼠源多克隆抗体,为深入探索寨卡病毒致病机制、检测方法和免疫策略奠定了研究基础。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

Immunogenicety and immunoprotection of recombinant PEB1 in Campylobacter-jejuni-infected mice

AIM: To construct a prokaryotic expression vector carrying Carnpylobacter jejuni peb1A gene and express it in Escherichia coli. Immunoreactivity and antigenicity of rPEB1 were evaluated. The ability of rPEB1 to induce antibody responses and protective efficacy was identified. METHODS: peb1A gene was amplified by PCR, target gene and prokaryotic expression plasmid pET28a (+) was digested with BamHI and XhoI, respectively. DNA was ligated with T4 DNA ligase to construct recombinant plasmid pET28a(+)-peb1A. The rPEB1 was expressed in E. coli BL21 (DE3) and identified by SDS-PAGE. BALB/c mice were immunized with rPEB1. ELISA was used to detect the specific antibody titer and MTT method was used to measure the stimulation index of spleen lymphocyte transformation. RESULTS: The recombinant plasmid pET28a (+)-peb1A was correctly constructed. The expression output of PEB1 protein in pET28a (+)-peb1A system was approximately 33% of total proteins in E.coli The specific IgG antibody was detected in serum of BALB/c mice immunized with rPEB1 protein. Effective immunological protection with a lower sicknessincidence and mortality was seen in the mice suffering from massive C. jejuni infection. CONCLUSION: rPEB1 protein is a valuable candidate for C. jejuni subunit vaccine.     

弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备

目的 制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法 以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E. coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体。最后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况。结果 同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列。PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白。结论 制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白。     

2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

目的 表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础。方法 分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化E.coil BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物。镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体。以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性。结果 成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23 kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP。制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1∶102 400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应。对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1 nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性。结论 成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys³³和Arg³⁹是LMW-PTP的活性位点。为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础。