神经营养因子-3修饰的神经干细胞移植大鼠受损脊髓后的存活及分化

目的 观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的神经营养因子(NT)-3修饰的胚胎脊髓来源的神经干细胞(NSCs)移植入受损脊髓后的存活及分化.方法 将体外构建的EGFP标记NT-3修饰的NSCs(NT-3-NSCs)移植入SD在胸9水平脊髓半切的大鼠(10只),通过免疫组织化学方法检测移植细胞的存活、分化及NT-3的表达,并与未进行NT-3修饰的NSCs移植组(NSCs)(10只)进行比较.结果 NT-3-NSCs组移植细胞存活数(304±40)比NSCs组(258±41)更多(P>0.05).NT-3-NSCs组中NT-3阳性细胞的比例(74.2±14.1)%明显高于NSCs组(22.9±11.1)%(P<0.01);NT-3-NSCs组中少突胶质细胞分化率(53.8±12.4)%明显高于NSCs组(39.7±13.7)%(P<0.05).结论 NT-3修饰能促进NSCs在受损脊髓内存活、表达NT-3及分化为少突胶质细胞,有助于NSCs移植对脊髓损伤(SCI)的治疗效果.     

硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤的影响

目的:研究硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66(1-40)antagonist peptide,NEP1-40]及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。方法:体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0μmol/L)诱导NSCs(前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs),诱导后鉴定NSCs特异性标志物,移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brdu)标记NSCs。将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=10)、损伤对照组(B组,n=10)、NSCs治疗组(C组,n=10)、NSCs联合Ch ABC治疗组(D组,n=10)、NSCs联合NEP1-40治疗组(E组,n=10)、NSCs联合Ch ABC和NEP1-40治疗组(F组,n=10)。移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型。术后3d,E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d,连续28d;术后8d,C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和Brd U标记的NSCs 10μl;术后8d,D组和F组经留置导管注入Ch ABC 10μl/d,连续7d;各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量。术前及术后不同时间点,用BBB评分和体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价。移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况,免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况。结果:体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养,可提高NSCs向神经元分化的比例。移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善,移植治疗各组均优于损伤对照组,组间BBB评分和SEP潜伏期有差异(P0.05);移植后2周、5周、8周各时间点,B组与C、D、E及F组比较,BBB评分和SEP潜伏期较差(P0.05);在移植治疗各组中,F组神经功能的恢复最明显,F组与C、D及E组比较具有较高的BBB评分和较短SEP潜伏期(P0.05)。移植后8周,HE染色显示:A组细胞结构完整、排列规则;B组组织结构严重破坏,细胞排列紊乱,见大量较大的囊腔及胶质瘢痕形成;C、D、E及F组细胞增生明显,囊腔较少。免疫荧光染色显示:C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,F组阳性细胞数多于C、D和E组,差异具有统计学意义(P0.05)。C、D、E、F组微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)标记阳性细胞数多于B组,F组多于C、D、E组,差异有统计学意义(P0.05);C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于B组,F组大于C、D、E组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ATRA诱导后NSCs移植可促进大鼠脊髓损伤功能的恢复,且联合Ch ABC和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用。     

大鼠神经干细胞经枕大池移植对脑损伤的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)经枕大池移植到创伤性脑损伤模型大鼠蛛网膜下腔中,观察其向损伤脑组织迁移及治疗效果。方法体外培养的NSCs取自子鼠皮层,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。采用Feeney’s自由落体脑创伤模型制成大鼠脑损伤模型,伤后24 h将NSCs经枕大池移植到蛛网膜下腔,伤前24 h、伤后24 h及1、2周行动物运动神经功能评分,分别于第1、2周处死取脑,行免疫组织化学染色检测BrdU、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果免疫组织化学染色表明,有BrdU( )NSCs迁移到脑内损伤灶并分化成MAP2 ( )神经元或GFAP( )胶质细胞。接受NSCs移植组大鼠与损伤组大鼠比较运动功能明显改善。结论NSCs具有从蛛网膜下腔迁移入脑内损伤组织、分化为神经元及神经胶质细胞并促进或改善神经功能恢复的能力。     

神经干细胞-多肽自组装凝胶复合体移植治疗脊髓损伤

目的 观察神经干细胞( NSCs)复合多肽自组装凝胶移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能修复的影响.方法 36只SD大鼠造模后1周随机分为3组,分别为DMEM/F12对照组(n＝12)、NSCs移植组(n=12)和NSCs-凝胶移植组(n=12).通过不同时间点BBB评分、病理组织学、免疫荧光技术评价脊髓损伤的修复.结果 移植后2周开始3组大鼠各时间点评分差异有统计学意义(P＜0.01),且组间差异均有统计学意义(P＜0.01);移植后6周,病理切片示C组大量再生的神经纤维桥接脊髓断端,胶质瘢痕不明显;免疫荧光染色示C组5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)/NF-200双标阳性细胞比例(24.83±1.47)％明显多于B组(6.83±1.47)％(P＜0.01),但B组BrdU/GFAP双标阳性细胞比例(42.17±2.71)％明显多于C组(34.33±4.63)％ (P＜0.01).结论 自组装多肽凝胶能提高神经干细胞向神经元分化的比例,复合移植能更有效地促进脊髓功能恢复.     

神经干细胞移植治疗结肠去神经节小鼠

目的 观察神经干细胞在去神经节小鼠结肠壁内的存活分化,探讨神经干细胞移植治疗结肠无神经节细胞症的可行性.方法 0.5%苯扎氯铵(BAC)处理8周龄昆明小鼠结肠浆膜层选择性去除结肠肇神经节制作巨结肠模型,原代培养新生小鼠大脑皮质来源神经干细胞,Hoechsd3342标记传代纯化后神经干细胞.运用微量注射器将标记后的神经干细胞移植入模型鼠病变肠段,分别于术后1、2、3、4周行大体观察,苏木素-伊红(HE)染色,免疫组织荧光检测小鼠生物学特性和神经干细胞存活分化情况.结果 原代培养神经干细胞Nestin表达阳性,体外培养可分化为神经元和神经胶质细胞;BAC处理后,HE染色及免疫组织化学染色显示小鼠结肠肌间及黏膜下神经节消失;神经干细胞移植后各观测时间点可见荧光标记细胞,免疫组织荧光检测显示术后1周结肠壁存在巢蛋白(Nestin)表达阳性细胞,3周后可见神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性细胞,对照组未观察到阳性表达.结论 神经干细胞可以在去神经节小鼠结肠肇内存活并分化为神经元及胶质细胞,部分恢复肠道神经的调节作用.     

血红蛋白氧载体通过蛋白激酶B信号通路抑制细胞凋亡减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤

目的探讨血红蛋白氧载体(HBOCs)对蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤的保护作用及机制。方法采用血管内穿孔法制SAH模型。将成年雄性Sprague-Dawley大鼠(贵州医科大学实验动物中心)按随机数字表法分为假手术(Sham)组、SAH组和HBOC组, 每组15只。HBOC组术后立即经股静脉输注15 ml/kg HBOCs, SAH组大鼠输注等体积乳酸林格氏液。术后24 h行SAH评分、神经功能评分及脑含水量的测定。采用尼氏染色和原位末端转移酶标记(TUNEL)检测神经元损伤及细胞凋亡。利用蛋白免疫印迹法检测蛋白激酶B(Akt)通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。组间比较采用t检验。结果 SAH组神经功能评分低于Sham组和HBOC组(14.97±1.70比17.80±0.32, t=6.363, P<0.05;14.97±1.70比16.33±1.44, t=2.383, P<0.05)。SAH组细胞凋亡率高于Sham组和HBOC组[(26.66±6.01)%比(3.90±1.83)%, t=14.030, P<0.05;(26.66±6.01)%比(11.30±4...     

经颈动脉注入神经干细胞治疗脑出血后遗症的时间窗及疗效

目的 探讨经颈动脉神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠脑出血(ICH)后遗症的适宜移植时间窗和疗效.方法 48只Wistar大鼠脑出血模型,随机分为实验组和对照组.分别于脑出血后第2、7、14、21、28天经颈动脉行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)体外标记的神经干细胞移植.对照组大鼠,仅接受颈动脉内注入等量DMEM培养液.每周测试大鼠行为功能评分;2个月后处死所有动物,行组织化学染色,观察神经干细胞在脑内的分布、分化,评定病灶体积大小.结果 与对照组比较,NSCs移植组大鼠行为功能改善明显(ANOVA,P＜0.05);脑出血第7天移植组在移植后第3周和ICH后第9周的行为功能评分显著优于其他时间移植组(SNK,P＜0.05).ICH后第7天和第14天移植组BrdU阳性细胞计数显著多于ICH后第2、21和第28天移植组.ICH后第2天移植的NSCs绝大部分分化为星形胶质细胞(84.5±7.6)%;而ICH后第21和28天移植的NSCs分化为神经元的比例明显增大(35.4±3.1)%、(37.2±4.1)%;然而,7～14 d移植组,分化为神经元的绝对数量显著高于其他治疗组(P＜0.01).结论 经皮颈动脉注射是一种可行的、微侵袭和高效的细胞移植方法.在脑出血后7～14 d期间进行神经干细胞移植,能显著提高细胞存活率和移植细胞分化为神经元,明显促进功能改善.     

NT-3基因修饰许旺细胞与神经干细胞联合移植促进大鼠全横断脊髓受损伤神经元的存活及其轴突再生

目的探讨神经营养素-3基因修饰许旺细胞（NT-3-SCs）与神经干细胞（NSCs）联合移植对大鼠因脊髓全横断而受损伤的神经元存活及其轴突再生的作用。方法将NT-3-SCs及LacZ报告基因修饰SCs（LacZ-SCs）与NSCs联合移植到全横断性脊髓损伤处，60d后在脊髓横断处尾侧注射荧光金（FG）进行逆行标记。第67天，取材进行组织学检测大脑皮质体感区、红核及脊髓横断处头侧FG标记神经元；大脑皮质体感区、红核和脊髓背核内存活的神经元以及脊髓损伤处再生的轴突。结果大脑皮质体感区、红核及脊髓L1背核内存活的神经元由多到少依次为NT-3-SCs与NSCs联合组、LacZ—SCs与NSCs联合组和实验对照组。NT-3-SCs与NSCs联合组和LacZ—SCs与NSCs联合组的大脑皮质体感区、红核和脊髓横断处头侧有FG标记神经元；脊髓横断处及其附近组织有5-HT、CGRP和SP阳性神经纤维。结论NT-3-SCs与NSCs联合移植能够促进脊髓全横断损伤后神经元的存活以及轴突再生。     

胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义

目的研究胞浆泛素蛋白连接酶2(Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2,KPC2)在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)过程中的蛋白表达及细胞定位情况,探讨其在SCI修复过程中的生物学功能。方法将成年SD大鼠随机分为2组,对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术,实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型,实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白A(Cyclin A)在SCI前后的蛋白表达变化,免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达,免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,Neu N)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和PCNA的共定位情况。细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型,Western blot检测KPC2、P27kip1、PCNA表达;免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27kip1之间在细胞增殖过程中的相互作用。结果 Western blot结果示SCI后3 d,p27kip1显著下调,伴随KPC2、Cyclin A、PCNA表达明显增加。免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布,包括脊髓灰质和白质,实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组(t=10.982,P=0.000)。免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质,对照组和实验组KPC2与Neu N双标记阳性细胞数分别为(0.43±0.53)、(0.57±0.53)个/视野,比较差异无统计学意义(t=0.548,P=0.604);在脊髓白质,对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为(3.86±0.90)、(0.71±0.49)个/视野,差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000);对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显,阳性细胞数分别为(0.57±0.53)、(5.57±1.13)个/视野,差异有统计学意义(t=8.101,P=0.000)。体外培养并模拟星形胶质细胞增殖,提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加,24 h达峰值,而p27kip1表达则逐渐减少。免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1,p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1,且在刺激后相互作用明显增加。结论 SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调,KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。     

脑源性神经生长因子和神经干细胞联合移植对大脑中动脉阻塞大鼠神经功能恢复的作用

目的 将脑源性神经生长因子(BDNF)和神经干细胞(NSCs)单独及联合移植应用于大脑中动脉阻塞(MCAo)模型大鼠,观察BDNF和NSCs移植对大鼠缺血性脑卒中神经功能恢复的作用及BDNF对内源性和外源性NSCs增殖、迁移及分化的影响.方法 体外分离、培养新生大鼠海马NSCs,BrdU标记.实验动物随机分为A组(MCAo组);B组(MCAo+BDNF组);C组(MCAo+NSCs组);D组(MCAo+BDNF+NSCs组),每组16只,移植后进行神经功能损害评分(NSS),用免疫组织化学行BrdU、nestin、BrdU/NSE检测,分析结果.结果 移植后的2、4周神经功能评分分别为:A组5.3±0.5、5.3±0.5;B组4.0±0.8、3.8±0.5;C组3.5±0.6、3.5±0.6;D组2.0 ±0.8、1.8±1.0,D组显著好于其他3组(P<0.05),B组与c组显著好于A组(P<0.05).nes.tin阳性细胞数:A组1.24±1.13,B组2.59±1.44(P<0.05),BrdU阳性细胞数:A组0.52±0.68,B组1.65±1.10(P<0.05).BrdU阳性细胞数:C组6.08±1.52,D组10.26±1.96(P<0.05),BrdU/NSE双阳性细胞数:C组1.74±1.04,D组3.58±1.20(P<0.05).结论 BDNF和NSCs移植单独及联合应用对MCAo大鼠的神经功能恢复均有作用,两者联合具有协同作用.BDNF对内源性NSCs的激活、增殖有促进作用,对外源性NSCs的增殖、迁移及分化有促进作用.     

核因子-κB在神经干细胞增殖过程中的调控作用

目的 观察核转录因子(NF)-κB信号通路的活化对体外培养的神经干细胞(NSCs)增殖的影响,探讨NF-κB在NSCs增殖过程中的调控作用.方法 采用成球悬浮法分离培养小鼠神经干细胞(mNSCs)并鉴定NSCs标志蛋白nestin;将生长状态良好的第3代mNSCs分为空白对照组、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、PDTC组,分别采用常规NSCs培养液、含10μg/L TNF-α的NSCs培养液、含0.1 mmol/L PDTC的NSCs培养液培养30 min、4 h和72 h;采用免疫荧光细胞化学方法 及蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测NSCs的NF-κB活化状况;采用免疫荧光细胞化学方法 检测增殖指标CyelinD1和Ki-67的表达,观察NSCs的增殖.结果 培养的mNSCs表达nestin:免疫荧光细胞化学方法 及Western blot结果显示,TNF-α可明显使p65活化由胞质转位至胞核;TNF-α组和空白对照组,CyclinD1阳性细胞率分别为(68.6±4.2)%和(38.8±3.7)%,明显高于PDTC组的(24.2±2.8)%(P＜0.05);Ki-67阳性细胞率分别为(48.2±3.6)%和(35.2±4.7)%,明显高于PDTC组的(18.7±1.8)%(P＜0.05).结论 NF-κB的激活或抑制可促进或抑制NSCs的增殖,NF-κB在NSCs的增殖过程中可能起着重要的调控作用.     

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/基质金属蛋白酶-9信号通路在芬太尼抑制人胃癌细胞侵袭和迁移中的作用

目的观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路在芬太尼抑制人胃癌MGC-803细胞侵袭和迁移中的作用。方法将人胃癌MGC-803细胞随机分为空白对照组(C组)、芬太尼组(F组),LY294002组(LY组),SB-3CT组(SB组),LY294002+芬太尼组(FLY组)和SB-3CT+芬太尼组(FSB组)。Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭迁移能力,实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测MMP-9和Akt的mRNA和蛋白质的表达,使用方差分析和独立样本t检验分析组间差异。结果F组胃癌细胞侵袭数低于C组(35.91±3.36比48.46±4.86,t=3.679,P<0.05)、迁移数低于C组(74.75±3.76比96.00±5.20,t=5.739,P<0.05)细胞迁移率(%)低于C组(14.29±4.29比22.43±3.37,t=3.591,P<0.05),Akt mRNA表达低于C组(0.77±0.02比1.00,t=8.110,P<0.05)、MMP-9 mRNA表达低于C组(0.87±0.08比1.00,t=2.967,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于C组(0.76±0.04比0.90±0.05,t=3.940,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于C组(0.76±0.05比0.94±0.04,t=4.774,P<0.05),差异均有统计学意义。FLY组胃癌细胞侵袭数低于LY组(18.45±4.86比33.62±4.13,t=4.999,P<0.05)、细胞迁移数低于LY组(42.79±3.56比71.79±7.60,t=5.986,P<0.05)和细胞迁移率(%)低于LY组(7.52±1.30比11.02±1.73,t=2.811,P<0.05),FLY组Akt mRNA表达低于LY组(0.60±0.05比0.76±0.17,t=3.468,P<0.05)、MMP-9 mRNA表达低于LY组(0.75±0.06比0.88±0.03,t=3.288,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于LY组(0.60±0.02比0.75±0.05,t=4.783,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于LY组(0.48±0.03比0.74±0.06,t=7.266,P<0.05),差异均有统计学意义。FSB组胃癌细胞侵袭数低于SB组(18.67±2.15比32.33±6.20,t=3.607,P<0.05)、细胞迁移数低于SB组(45.67±4.63比75.04±4.47,t=7.898,P<0.05)和细胞迁移率(%)低于SB组(7.09±1.69比14.39±2.06,t=4.745,P<0.05),FSB组Akt mRNA表达低于SB组(0.53±0.11比0.76±0.07,t=2.950,P<0.05)、MMP-9 mRNA低于SB组表达(0.63±0.07比0.84±0.01,t=3.687,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于SB组(0.61±0.03比0.75±0.04,t=4.573,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于SB组(0.53±0.07比0.72±0.05,t=3.730,P<0.05),差异均有统计学意义。芬太尼可降低细胞侵袭和迁移能力,MMP-9和p-Akt表达减少,且芬太尼联合LY294002或SB-3CT较单独用药时进一步加强了抑制效果。结论芬太尼抑制人胃癌MGC-803细胞侵袭和迁移的机制与抑制PI3K/Akt/MMP-9信号通路有关。     

大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

沙门菌致病岛1蛋白促进神经母细胞瘤Warburg效应的作用及分子机制

目的探讨沙门菌致病岛1(SPI1)蛋白在神经母细胞瘤中调控有氧糖酵解(即Warburg效应)的作用及分子机制。方法运用公用数据库,解析神经母细胞瘤中调控Warburg效应的候选关键转录因子SPI1;经嘌呤霉素筛选,获得稳定过表达/敲低SPI1的SK-N-BE(2)细胞株,分为空载体对照(Mock)组、SPI1过表达(SPI1)组、随机干扰(sh-Scb)组、SPI1干扰(sh-SPI1)组;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因及蛋白质印迹法(Western blot)检测靶基因启动子活性和表达水平;分光光度计法和糖酵解压力试验检测有氧糖酵解水平;软琼脂克隆形成和基质胶侵袭检测瘤细胞的增殖和侵袭活性。组间比较采用t检验。结果SPI1组己糖激酶2(HK2)表达高于Mock组(3.63±0.53比1.00±0.05,t=17.462,P<0.05),磷酸甘油酸激酶1(PGK1)表达高于Mock组(3.28±0.39比1.00±0.03,t=17.651,P<0.05),细胞外酸化率(ECAR)高于sh-Scb组[(32.17±3.15)mpH/min比(9.82±1.49)mpH/min,t=10.352,P<0.05],克隆形成数高于Mock组[(163.30±7.59)个比(48.02±4.85)个,t=17.840,P<0.05],侵袭细胞数高于Mock组[(184.70±10.58)个比(88.33±5.56)个,t=8.214,P<0.05]。sh-SPI1组HK2表达低于sh-Scb组(0.33±0.02比1.00±0.04,t=14.370,P<0.05),PGK1表达低于sh-Scb组(0.34±0.02比1.00±0.03,t=19.192,P<0.05),ECAR值低于sh-Scb组(3.07±0.48比10.05±1.37,t=7.580,P<0.05),克隆形成数低于sh-Scb组[(21.33±3.96)个比(44.67±5.69)个,t=5.916,P<0.05],侵袭细胞数低于sh-Scb组[(40.67±3.48)个比(88.00±6.89)个,t=4.994,P<0.05],差异均有统计学意义。结论转录因子SPI1通过增强HK2和PGK1表达,促进神经母细胞瘤的Warburg效应和肿瘤进展。     

紫杉醇通过自噬相关蛋白7介导的自噬抑制人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移

目的探究自噬在紫杉醇(PTX)抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制。方法使用紫杉醇作用人主动脉平滑肌细胞(HASMCs), 采用细胞计数盒(CCK-8)法和5-乙炔-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入法检测紫杉醇对HASMCs的增殖能力的影响, 采用划痕实验检测紫杉醇对HASMCs迁移能力的影响, 蛋白质印迹法(Western blot)及利用GFP-RFP-LC3Ⅱ-HASMCs观察PTX对自噬关键蛋白LC3Ⅱ表达水平的影响;利用自噬相关蛋白7(ATG7)小干扰RNA转染HASMCs, 抑制自噬水平, 检测PTX对HASMCs增殖及迁移能力的作用。两组间比较采用t检验。结果在紫杉醇作用下, 其细胞活性在2.5 nmol/L组(0.669 ±0.010, t=17.620, P<0.01)及5 nmol/L组(0.535±0.012, t=22.300, P<0.01)时明显低于对照组(1.008±0.018);Edu阳性细胞率在2.5 nmol/L组(0.356±0.016, t=14.380, P<0.005)与5 nmol/L组(0.293±0.018, t=1...     

复方麝香注射液在人脐带间充质干细胞神经分化中的作用

目的 观察复方麝香注射液在体外对人脐带间充质干细胞(hUMSCs)神经分化的影响.方法 取足月妊娠剖宫产健康新牛儿脐带,获取间充质干细胞,采用流式细胞术进行细胞表型鉴定.以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h,再以含5、10、15、20、25g/L复方麝香注射液的无血清培养基进行神经分化诱导,采用免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微观相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 流式细胞检测显示hUMSCs表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166和HLA-ABC抗原,不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133和HLA-DR抗原.经不同浓度复方麝香注射液诱导5 d后,各诱导组中均出现神经样细胞.5、10、15、20、25 g/L组显微镜每随机视野中NSE阳性细胞数分别为19.00±3.61、66.60±5.37、60.20±10.06、44.80±9.44、47.80±10.45,MAP-2阳性细胞数分别为9.20±3.27、53.40±10.92、59.40±10.41、46.60±8.88、46.80±8.93.以10 g/L和15 g/L组中的NSE、MAP-2阳性细胞数为最多.各诱导组中仅极少数细胞呈GAFP弱阳性.结论 人脐带富含问充质干细胞(MSCs),适量复方麝香注射液可有效诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元细胞.     

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.     

人骨形态发生蛋白-4@MSNs调控Wnt/β-连环蛋白信号促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨介孔二氧化硅(MSNs)纳米颗粒负载人骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响和作用机制。方法制备BMP-4@MSNs, 扫描电镜观察其形态和表征, 计算BMP-4的载药量、包封率和体外缓释率。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测BMSCs增殖能力, 茜素红染色检测BMP-4@MSNs对BMSCs的成骨诱导能力, 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs的相关成骨基因和蛋白表达。组内比较采用One-way ANOVA分析。结果合成的BMP4@MSNs直径大小为(140.4±1.683) nm, 载药量为29.4%, 包埋率为84.9%。BMP4@MSNs组细胞增殖高于MSNs组在第3天(1.13±0.07比1.35±0.16, t=3.545, P<0.05)、第5天(1.39±0.08比1.64±0.07, t=3.401, P<0.05)、第7天(1.65±0.10比2.11±0.20, t=5.069, P<0.05)。BMP4@MSNs组的成骨矿化结节茜素红染色深...     

自组装peptide胶对神经干细胞在大鼠急性损伤脊髓中细胞分化的影响

目的 观察自组装peptide胶对神经干细胞(NSCs)在大鼠急性期损伤脊髓中的细胞分化的影响.方法 分离、培养和鉴定大鼠NSCs与自组装peptide胶共培养;SD大鼠25只采用NYU-Ⅱ型脊髓打击器制作T10脊髓损伤模型;急性期于损伤脊髓区分别行注射移植,其中联合细胞移植组(n=10)、单纯细胞移植组(n=10)及对照组(n=5).术后第2、4、8周取损伤部位脊髓,免疫组织化学染色检测移植细胞的分化.结果 成功建立大鼠NSCs的体外培养体系;移植的NSCs在大鼠脊髓内存活超过8周,单纯移植组、细胞分化比例较低,分化的NSCs主要为表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原细胞,未见NSCs分化为表达微管相关蛋白(MAP2)标志抗原细胞;联合移植组,细胞分化比例较高;NSCs可分化为表达MAP2、Oligo、GFAP标志抗原细胞.结论 自组装peptide胶能够提高神经干细胞在大鼠急性期损伤脊髓中的分化比率,并有部分细胞可分化为表达神经元特异抗原的细胞.     

神经干细胞移植对大鼠脑外伤的治疗作用

目的 通过神经干细胞（NSCs）移植治疗大鼠自由落体撞击脑损伤来探讨NSCs对脑损伤修复的影响。方法 体外培养NSCs并用5—2溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记．自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区制作脑外伤模型，脑外伤后24小时内移植NSCs，分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、4周时行神经运动行为学评分（NMFE）和免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷酯（GalC）蛋白表达。结果 大鼠自由落体撞击伤后．右下肢神经运动功能障碍明显。神经运动行为学评分在第1周时，实验组与对照组无明显差异，而在第2、4周时，实验组的评分明显低于对照组，统计学处理，P〈0．05，有明显统计学差异。第2、4周时实验组NSE．GFAP和GalC染色阳性细胞数要多于对照组．nestin染色在第1周时表达最高，后逐渐下降。BrdU阳性细胞在损伤灶中心区最高多．在损伤灶的远隔部位也有少许发现。结论 NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复。移植的NSCs可以在损伤部位存活．并增殖分化与迁移。