耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

目的 构建耐辐射奇球菌(D．rdiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E．coli BL21(DE3)中表达。方法 用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a( )连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)。用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果 获得了D．radiodurans-Mn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E．coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51800u／g湿菌体。结论 成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D．radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv株Rv1494和Rv1495 假想蛋白基因的克隆表达

目的 为探索参与调控结核分枝杆菌(MTB)持续性感染的相关分子,对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆、表达及Western blotting鉴定.方法 采用Bioedit、Dnaman软件及Pfam数据库对MTB H37Rv株Rv1494、Rv1495基因编码蛋白质的氨基酸组分、蛋白模块以及其与大肠杆菌E.coli的mazEF蛋白家族的同源性进行分析.以H37Rv株基因组为模板,分别对Rv1494、Rv1495基因进行克隆,构建pET32a( )原核表达质粒,转化BL21宿主菌.重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离纯化和Western blotting鉴定.结果 生物信息学分析提示,Rv1494基因、Rv1495基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌E.coli染色体编码的mazEF家族中的抗毒素和毒素具有一定程度的同源性,分别为26%和29.75%;经测序表明原核表达重组质粒构建成功.负载重组质粒的BL21菌经IPTG诱导后可表达出分子大小与预期值相一致的融合蛋白,表达量均可达到菌体总蛋白的60%.重组蛋白经Western blotting检测出特异性阳性信号.结论 首次对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆表达,为进一步探讨该基因在参与调控MTB持续性感染过程中的功能奠定基础.     

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的 利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析.方法 将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性.结果 转化溶原菌后能够表达目的 蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白.Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性.结论 利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复.     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

结核分枝杆菌特异性抗原Rv3117的克隆表达和诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的 克隆表达结核分枝杆菌Rv3117蛋白,并进行诱导小鼠免疫应答的初步研究.方法 通过聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌Rv3117基因,克隆入pET32a载体,构建重组质粒pET32a-Rv3117,转化入大肠埃希菌BL21(E.coli) plysS(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定其表达情况;以目的蛋白免疫C57BL/6小鼠血清并行Western blotting分析.结果 成功构建原核表达载体pET32a-Rv3117,获得纯化的目的蛋白,其在E.coli BL21 plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,相对分子质量(48 100)与预期相符.Western blotting分析结果显示在目标位置有阳性条带.结论 成功克隆结核分枝杆菌重组蛋白Rv3117,其能够诱导C57BL/6小鼠的免疫应答.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺样毒素A亚单位(Shiga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westen blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2a基因约950bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%.结论EHEC O157:H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157:H7菌的感染机制奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target，ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP10）的融合蛋白，通过免疫动物，获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板，扩增cfp10-esat6融合基因，将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白，经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔，获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体，作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功，融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达，多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白，制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体，为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌TB15.3蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达及亲和层析技术,得到纯化的重组TB15.3蛋白。方法通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组中扩增出TB15.3蛋白的编码基因,再将其连接入PET-30a表达载体中,以E.coli BL21（DE3）菌株为宿主菌通过IPTG诱导表达,并通过亲和层析法纯化目的蛋白。结果通过IPTG诱导后得到目的蛋白,并且目的蛋白以可溶性蛋白形式表达。结论成功得到纯化的目的蛋白,为以后的实验奠定基础。     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌H37Ra株fbpC基因的克隆与表达

目的：探讨克隆结核杆菌H37Ra菌株抗原fbpC基因及在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法：通过聚合酶链反应扩增人结核杆菌弱毒性菌株H37Ra的编码基因ibpC,并定向克隆到原核表达载体pET-28a,通过酶切、聚合酶链反应和测序鉴定重组质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）中,由异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺和Westernblot鉴定表达的重组蛋白。结果：成功构建了pET28a—fbpC重组质粒;在大肠埃希菌中表达了相对分子量约33000的重组蛋白。结论：重组质粒pET28a—fbpC成功构建和表达,为fbpc反应原性、免疫诊断价值的研究提供参考。     

结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌复活促进因子B(RpfB)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfB基因(1089bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了RpfB蛋白;利用Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现61KDa处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfB基因的重组表达质粒pET32a( )-RpfBv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.