肺炎克雷伯菌KbvR调控因子对细菌生物膜与荚膜形成能力的影响

目的构建肺炎克雷伯菌LuxR家族KbvR基因缺失突变株与回补株,分析KbvR在肺炎克雷伯菌生长、生物膜形成及荚膜 生成中的作用。方法通过自杀载体pKO3-Km质粒构建KbvR基因敲除株,然后扩增出包含KbvR基因编码区、启动子结合区及 转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-T-easy质粒上构建KbvR基因回补株。绘制不同菌株生长曲线,了解KbvR对细菌生长的 影响。通过结晶紫定量实验检测KbvR基因对细菌生物膜形成的影响,拉丝实验、离心试验及RT-PCR检测KbvR基因对细菌荚 膜形成的影响。结果成功获得KbvR基因缺失突变株及回补株,RT-PCR结果显示KbvR基因在缺失突变株中不表达,在回补株 中重新表达。KbvR基因不影响细菌的生长速度,基因敲除株后细菌生物膜形成及荚膜生成能力下降。体外试管静止培养48 h, 与野生株相比基因缺失突变株生物膜形成能力明显下降,而KbvR基因回补株在液体培养基表面能形成明显生物膜。结晶紫染 色定量实验发现,基因缺失突变株生物膜形成能力显著低于野生株（P<0.01）。超粘性实验和RT-PCR结果均显示,KbvR基因缺 失突变株荚膜形成能力明显下降,说明KbvR基因影响肺炎克雷伯菌生物膜和荚膜的形成。结论KbvR基因作为密度感应系统 LuxR孤儿调控转录因子,正调控肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜是细菌生物膜形成的重要因素,KbvR基因可通过影响荚膜 形成而调控生物膜的形成。     

副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用

目的建立以pBAD33质粒为载体的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）基因回补实验平台。方法PCR扩增aphA
和opaR的整个ORF区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,构建重组质粒。分别将重组质粒转入到ΔopaR 和ΔaphA中（分
别代表opaR 和aphA的突变株）,以构建出相应的回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。分别在aphA和opaR基因内设计特异性引物,采
用RT-PCR 方法,验证在相应的回补突变株中aphA 和opaR 是否转录。利用引物延伸实验研究野生株（WT）、ΔopaR 、ΔaphA、
C-ΔaphA 和C-ΔopaR中mfpA（aphA负调控,opaR正调控其表达）的相对RNA水平。结果aphA和opaR在相应的回补株中发生
转录;且mRNA水平与野生株一致。结论成功建立了以pBAD33质粒为载体的VP基因回补方法,并得到应用。     

表皮葡萄球菌mscL 基因突变株的构建及其生物学功能

目的初步探讨表皮葡萄球菌mscL 基因的生物学功能。方法构建含有壮观霉素抗性基因（spc）的同源重组质粒
pMAD-ΔmscL,电转入表皮葡萄球菌1457,在42 ℃条件下振荡培养,利用蓝白斑和抗生素抗性筛选表皮葡萄球菌mscL基因敲除
突变株（SE1457-ΔmscL）。通过检测低渗胁迫前后突变株和野生株D600值及CFU的变化观察mscL基因对渗透压的调节作用。
采用微量板半定量方法检测不同条件下mscL 敲除突变对细菌生物膜形成的影响。结果成功构建同源重组质粒pMAD-
ΔmscL,经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌mscL基因敲除突变株,并通过RT-PCR在转录水平上得到进一步验证。处
于对数生长期的mscL突变株在低渗胁迫下的生存能力显著降低,但其生物膜形成能力与野生株相比无显著差异。结论表皮
葡萄球菌mscL基因可在对数生长期参与渗透压的调节,但对生物膜的形成无影响。
     

副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的 摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义.方法 通过融合PCR技术将目的 基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株.结果 成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株.结论 通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能.     

肺炎克雷伯菌CRP调控子对细菌毒力影响与机制研究

目的:了解肺炎克雷伯菌调控因子CRP对细菌毒力的影响及其对毒力相关因子磷酸转移酶系统的作用及其机制。方法:构建肺炎克雷伯菌CRP调控因子的基因缺失突变株与回补株,小鼠毒力试验检测CRP对细菌LD50的影响及小鼠生存率的影响,qRT-PCR与lac Z报告基因检测CRP对果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因的影响并通过凝胶阻滞试验(EMSA试验)检测CRP调控frwC基因的机制。结果:CRP基因敲除菌株的小鼠毒力明显下降,野生株、CRP基因缺失株及回补株的LD50分别为<100,3.2×10~5和4.5×10~4CFUs。qRT-PCR与lac Z报告基因发现CRP基因敲除后,果糖磷酸转移酶系统EIIC蛋白frwC基因表达量明显下降,EMSA试验发现CRP蛋白能够结合在frwC启动子区。结论:肺炎克雷伯菌CRP调控子与细菌毒力密切相关,并且能够直接正调控frwC基因的表达。除影响细菌荚膜、菌毛、生物膜的形成而影响细菌毒力外,CRP调控子可能通过影响磷酸转移酶系统而影响细菌毒力。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF 基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD 33质粒为载体的espF
基因回补实验平台。方法设计1 对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46 质粒的
EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核
苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采
用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录。结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的
EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用
Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回
补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础。
     

VPA0961对副溶血弧菌运动能力的调控

目的: 构建vpa0961基因突变株及其回补株,并初步探究VPA0961对副溶血弧菌运动能力的调控作用。方法: 以副溶血弧菌RIMD2210633野生株的基因组DNA为模板,PCR扩增得到vpa0961的同源臂融合片段,并克隆至自杀质粒pDS132多克隆位点。将pDS132重组质粒通过结合转移的方式转入野生株,进而通过同源重组方法替换原始vpa0961,制备vpa0961无痕突变株(Δvpa0961)。PCR扩增vpa0961整个编码区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒,获得重组回补质粒。将回补质粒结合转移到Δvpa0961中,然后通过特异性引物PCR鉴定并外送测序以获得回补株。将副溶血弧菌的预培养物接种于游动(swimming)和爬动(swarming)平板,37℃静置培养,比较不同菌株间菌苔直径的差异。采用qRT-PCR分析鞭毛蛋白基因lafA、flaB和flaF的mRNA表达水平。结果： 特异性扩增及序列分析显示,成功构建vpa0961基因突变株和回补株;与野生株相比,Δvpa0961游动能力和爬动能力明显减弱(t=14.06,36.37,P<0.05);与野生株相比,Δvpa0961 lafA、flaB和flaF mRNA转录水平明显降低(t=185.2,56.36,50.24,P<0.05)。结论： 成功构建vpa0961的基因突变株和回补株,且VPA0961对鞭毛基因的转录具有正调控作用。     

双组分信号转导系统SrrBA调控表皮葡萄球菌生长和生物膜形成

目的:探讨双组分信号转导系统SrrBA在表皮葡萄球菌中的调控作用。方法:利用同源重组技术构建表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株,通过检测OD600值绘制其有氧生长曲线,并观察其厌氧生长状态,微量板半定量方法检测其生物膜形成能力。结果:经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株(SE 1457-ΔsrrBA)。突变株的生长不论是在有氧还是在厌氧条件下均明显滞后于野生株。此外,突变株形成生物膜的能力较之野生株也显著下降。结论:双组分系统SrrBA可调控表皮葡萄球菌的生长和生物膜形成。     

单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的构建

 目的构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株。方法 克隆fbpa及其上、下游基因,构建其载体质粒;通过酶切反应将上、下游基因分别重组到载体质粒中,形成同源重组质粒;同源重组质粒电转入细菌内,进行同源重组;采用PCR、Western blot鉴定敲除菌株。结果 单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株基因组DNA无fbpa基因片段,且无FbpA蛋白表达。结论 成功构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株     

aroC基因对迟缓爱德华氏菌生物学特性及致病性的影响

目的:探讨aroC基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,Et)致病过程中的作用。方法:采用自杀质粒同源重组方法制备Et的aroC基因缺失株(ΔaroC)和aroC的互补株(CΔaroC);通过生物膜形成、运动性、细胞黏附、斑马鱼致病性、组织细菌载量等实验,分析aroC对Et致病性相关的生物学功能的影响。结果:aroC基因的缺失不影响Et生长速度;与野生株和CΔaroC相比,ΔaroC的生物膜形成能力、运动能力、黏附及胞外吲哚生成能力均显著降低(P<0.05或<0.01);qRT-PCR结果显示,相比于野生株,ΔaroC鞭毛合成基因fliA和fliC的转录水平显著下降(P<0.01),但flgK、flgL和fliS基因的转录水平无明显变化(P>0.05);与野生株相比,感染ΔaroC的斑马鱼症状明显减轻、存活率高,且ΔaroC在小鼠肠道和肝脏中的定植数目显著减少(P<0.05或<0.01)。结论:aroC基因影响Et的运动性、生物膜形成、黏附性等,进而调控Et对宿主细胞的致病力。     

同源重组构建表皮葡萄球菌附属基因调节子（agr）阴性突变株（摘要）

目的构建表皮葡萄球菌agr阴性突变株，以期得到除agr基因以外相同遗传背景的突变株与野生株。方法首先构建同源重组质粒pBT2-Δagr，后电传入金黄色葡萄球菌RN4220，再转入表皮葡萄球菌3298。通过pBT2载体对温度敏感的特点，含重组质粒的表皮葡萄球菌3298在40℃多次传代，最终筛选出agr阴性的突变株。结果同源重组质粒pBT2-Δagr通过酶切鉴定证明构建成功，     

肺炎克雷伯菌CRP对kfuABC操纵子的转录调控机制研究

目的：利用分子生物学实验研究肺炎克雷伯菌环磷酸腺苷受体蛋白（cAMP receptor protein,CRP）对kfuABC操纵子的转录调控机制。方法：设计相关跨基因引物,用Real-time PCR方法验证kfuABC的转录结构。以肺炎克雷伯菌野生株NTUH-K2044（wild type,WT）的总RNA为模板,利用引物延伸的方法寻找kfuA的转录起始位点,确定其核心启动子区。构建含kfuA启动子区DNA序列的LacZ重组质粒,并将其转入突变株?驻crp（肺炎克雷伯菌野生株基因组中crp基因敲除）和WT中,通过测定比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来判定CRP调控子对kfuA的调控关系;分别提取?驻crp和WT的总RNA,进一步采用实时定量Real-time PCR的方法验证CRP对kfuA的调控关系。通过凝胶阻滞实验验证His-CRP是否对kfuA启动子区具有直接的结合作用,进一步采用 DNaseⅠ足迹实验确定具体的结合位点。结果：肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于同一个操纵子kfuABC;引物延伸实验结果显示kfuABC只有一个转录起始位点T;CRP能够结合到kfuABC启动子区-204到-171之间的碱基序列上（转录起始位点为+1）,抑制其转录表达。结论：CRP能直接结合到kfuABC启动子区抑制其转录表达。     

luxS基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力的变化

目的探讨LuxS基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响。方法以临床分离大肠杆菌S17为研究对象,PCR分别扩增S17 LuxS基因的上下游序列和质粒pEGFP-N1的卡那抗性基因,分别连入T载体pAT2,再通过酶切连接的方法分别将LuxS基因的上、下游序列连接入pAT2-kana质粒,构建同源重组质粒pAT2-△luxS,同源重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增后,提取质粒后双酶切获得同源重组片段,将同源重组片断电转入感受态S17,通过同源重组构建LuxS基因缺失的S17,96孔板结晶紫染色法分析LuxS基因缺失株生物膜形成能力的变化。结果 LuxS基因缺失株基因组PCR扩增出1678的片断,测序鉴定正确,成功构建临床分离大肠杆菌S17 LuxS基因缺失株,S17与S17LuxS基因缺失株形成生物膜的微孔板法半定量OD值的结果分别为(1.51±0.09)和(0.43±0.13)。结论 LuxS基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。     

伤寒沙门菌核糖核酸酶 G对胞内非编码RNA T3956水平的影响

目的: 研究伤寒沙门菌核糖核酸酶G（RNase G）对非编码RNA（ncRNA）T3956胞内水平的影响。方法: 利用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌RNase G基因（rng）缺陷变异株;利用重组质粒pBAD将rng导入rng缺陷变异株,构建rng缺陷回补株;通过实时定量PCR分别比较伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、回补株等在不同生长时期的ncRNA T3956水平。结果: 成功制备伤寒沙门菌rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株; 实时定量PCR结果表明,rng缺陷株中T3956的胞内水平较野生株有所升高,并且在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株胞内T3956的水平又得到恢复。结论: 伤寒沙门菌RNase G能够参与对胞内ncRNA T3956水平的调控,并且在细菌对数生长中期和稳态期作用更为明显。     

沙门菌质粒对细菌生物膜形式的影响

目的研究伤寒沙门菌质粒pRST98对生物膜形成的影响。方法将携带pRST98的野生型伤寒沙门菌于30℃和37℃培养3 d,用半定量法确定生物膜形成的适宜温度。将稀释的菌液于30℃分别培养12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和5 d,用半定量法确定生物膜成熟的时间。分别用携带pRST98的野生型伤寒沙门菌,消除pRST98的突变株及pRST98的回补株建立生物膜模型,用结晶紫染色法,半定量法和扫描电镜观察三种株受试菌形成生物膜的能力。结果在30℃培养时细菌生物膜形成能力高于37℃,此温度为沙门菌生物膜形成的适宜温度;3 d时生物膜趋于成熟;野生株和回补株形成生物膜的能力显著高于突变株。结论伤寒沙门菌质粒pRST98与该菌生物膜形成密切相关。     

hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

目的 建立大肠埃希菌Red重组系统无痕敲除方法,探讨hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响.方法 以大肠埃希菌MG1655为研究对象,将pKD46质粒转化入MG1655感受态细胞.以质粒pKD3为模板扩增氯霉素抗性基因片段,并将其转化入MG1655/pKD46,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆.利用pCP20质粒删除氯霉素抗性基因,构建MG1655 hns基因缺失菌株.96孔板结晶紫染色法分析MG1655 hns基因缺失株生物膜形成能力的变化.苯酚-硫酸法检测细菌胞外多糖含量.结果 氯霉素抗性基因消除后的hns基因缺失株PCR产物长度为434 bp,测序鉴定正确,成功构建MG1655 △hns基因缺失株.MG1655△hns菌株生物膜形成能力和胞外多糖产生显著低于MG1655(P＜0.01).结论 利用Red重组技术成功构建出MG1655△hns菌株,hns基因对细菌生物膜的形成具有重要的调控作用.     

金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响

目的 利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响.方法 分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株.并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究.结果 突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atlA基因编码的双功能自溶素前体蛋白(AtlA蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atlA基因的转录水平较野生株显著降低.结论 psmα缺失后能够降低atlA基因的转录表达水平.     

类鼻疽伯克霍尔德sRNA敲除株的构建及生物学功能初步评价

目的：构建类鼻疽伯克霍尔德菌（burkholderia pseudomallei,B. pseudomallei）sRNA基因敲除菌株，并对其生物学功能进行初步评价。方法：设计合成引物9sF/9sR、9xF/9xR、R1/F1，扩增sRNA基因上下游同源臂片段，通过酶切、连接和转化，将目的片段克隆至质粒TPR-pK18mobSacB上，运用同源重组的方法获得类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA敲除菌株。结果：类鼻疽伯克霍尔德菌敲除株△sRNA构建成功。与野生株HNBP001比较，△sRNA生长速度、泳动能力、生物被膜形成能力均下降，药敏结果无差异。结论：成功构建类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA基因敲除株，为进一步研究sRNA在类鼻疽伯克霍尔德菌中的调控机制提供了基础。     

黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因的敲除与功能鉴定

目的构建黏液型铜绿假单胞菌64(PA-64)株2815基因敲除株PA-64/ΔPA2815,建立有效的PA2815基因敲除平台。方法利用自杀质粒p CVD442及基因同源重组技术敲除PA-64株PA2815基因,并采用PCR及测序检测方法筛选获得PA2815基因被Gm抗性基因取代的克隆,命名为PA-64/ΔPA2815。比较敲除株与野生株之间的生长特性、抗生素的敏感性、藻酸盐以及绿脓菌素分泌的差异。结果 PA-64/ΔPA2815菌株与野生株的PA2815基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少1 480 bp,成功构建了黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除株。体外实验证实敲除株相比野生株生长速度略慢,藻酸盐分泌显著降低,差异有统计学意义(P0.05),而绿脓菌素分泌显著升高(P0.05),但在抗生素的敏感性方面差异无统计学意义(P0.05)。结论利用同源重组原理成功构建黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除平台;PA2815基因不影响黏液型铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,但可以正向调控其藻酸盐的分泌和菌落生长状态,负向调控绿脓菌素的分泌。     

尿路致病性大肠杆菌iha基因敲除及其对细菌生物膜形成的影响

目的构建尿路致病性大肠杆菌(UPEC)W140菌株的黏附素基因iha缺陷株,分析iha基因缺失对UPEC生物膜形成的影响。方法采用Red重组系统的3种质粒(pKD46、pKD3、pCP20)敲除W140菌株的iha基因。pKD46表达λ噬菌体的3个重组蛋白,转入W140菌株使其具有同源重组能力。以pKD3携带的两侧带有翻转酶结合位点(FRT)的氯霉素抗性基因替换目的基因iha,再利用表达翻转酶重组酶的质粒pCP20将FRT之间的氯霉素抗性基因删除,从而获得iha基因敲除菌株。采用结晶紫染色法比较野生菌株与基因敲除菌株的细菌生物膜形成差异。结果 PCR验证和DNA测序表明,UPEC W140菌株染色体上的iha基因被成功敲除,得到iha基因缺陷株UPEC W140Δiha。基因缺陷菌株与野生菌株相比生物膜形成能力降低(P<0.01)。结论 iha基因及其编码产物参与UPEC生物膜的形成,通过抑制该基因的表达有望为控制尿路感染提供新的靶点。