全骨髓法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种体外纯化及培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MsCs）的简便有效方法。方法全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况：利用四唑盐比色（MTT）法测定MSCs的生长曲线：流式细胞仪（FCM）鉴定MSCs膜抗原。结果SD大鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含10％优质胎牛血清DMEM培养基混合,约5-10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24-48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7-12d时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。FCM检测第4代MSCs膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1．50％、99．18％、97．70％。结论SD大鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的SD大鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。为本实验研究打下基础。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性，研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法分离MSC，进行培养扩增，观察其生物学特性；用5-杂氮胞苷（5-AZA）诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化，并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增；流式细胞仪分析所培养的B代细胞为纯度超过95％的MSC；P3代MSC经5-AZA诱导后1周，相差显微镜下见细胞呈长梭形、多核；2周可见肌管样结构；细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养，体外培养条件下生长良好，可连续传代，在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及生长特性的初步研究

目的:探索兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离及培养扩增的方法。方法:骨髓穿刺法抽取雄性新西兰白兔髂骨骨髓5ml,联合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化MSC并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态。结果:成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法,生长动力学分析发现,传代细胞随传代次数的增加,增殖能力逐渐下降。结论:兔MSC能在体外成功培养、扩增,可作为组织工程的种子细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性,研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSC,进行培养扩增,观察其生物学特性;用5-杂氮胞苷(5-AZA)诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增;流式细胞仪分析所培养的P3代细胞为纯度超过95%的MSC;P3代MSC经5-AZA诱导后1周,相差鼹微镜下见细胞呈长梭形、多核;2周可见肌管样结构;细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（MSC）的体外分离、培养和增殖,探讨其生物学特性。方法：自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化MSC,并培养、增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,绘制细胞生长曲线,同时计算贴壁率。结果：体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;生长曲线为典型的S形曲线;MSC的贴壁率高,第3代培养14h贴壁率达90%以上。结论：用密度梯度离心法分离MSC是可行的。分离获得的MSC体外培养显示,MSC生长稳定,增殖速度快。MSC将是骨组织工程理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

骨髓间充质千细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100％。荧光显微镜观察。可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。     

小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染

目的探索脂肪源间充质干细胞（ADMSCs）的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的最佳感染指数（MOI）,并鉴定其感染后的增殖能力,为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据。方法取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织,差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞。经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5％CO2孵箱中培养,24h后换液,以后每3d更换培养基,待细胞融合达到约90％时,传代培养。取第3代ADMSCs用流式细胞术（FCM）检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能;用携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体（LV）感染ADMSCs,FCM检测病毒感染效率,四甲基偶氮唑蓝（MTY）比色法检测感染后的细胞活力。结果（1）差速贴壁法培养分离7-11d时细胞融合达80％以上。原代细胞融合达80％～90％进行1：4传代,细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养。第3代及再传代细胞形体趋于一致,细胞呈梭形。细胞连续传代10次,生长速度未见明显减缓;（2）FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98．93％,CD34阳性表达0．17％;（3）第3代细胞成脂诱导14d油红O染色阳性,成骨诱导14d茜红染色阳性;（4）当MOI=25感染第3代细胞72h后,共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％～70％,细胞活力不受影响;（5）MrIT法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较,细胞增殖能力无差异。结论从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代;差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs;携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs,并且感染后其增殖能力不受影响。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨兔骨髓基质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,流式细胞仪检测第3代MSC表面抗原的表达情况。结果体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;MSC阳性表达CD29,CD90,但CD34,CD45呈阴性。结论利用密度梯度离心法获取的MSC具有大量增殖的能力,表达CD29,CD90,不表达CD34,CD45。     

绿色荧光蛋白标记大鼠间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞（MSCs）的方法。方法 用密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定，以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Ad-GFP转染MSCs，流式细胞仪检测即时、15 d和30 d的标记率；通过流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率，CCK-8法检测增殖能力，明确标记后细胞的生长特性；通过流式细胞仪检测标记后细胞表面标志（CD29、CD34、CD44和CD45）表达的变化。结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的即时标记率高达89.71%，15 d和30 d的标记率分别为：85.10%、82.92%。标记后细胞周期的分布、凋亡率、增殖能力与未标记细胞相比，差异无显著性（P>0.05）。标记后细胞表面标志的表达亦不受影响。结论 重组腺病毒载体Ad-GFP能高效标记MSCs，且标记后细胞的增殖能力不受影响，表面标志的表达不发生改变。     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的探讨慢性高原病（chronic mountain sickness,CMS）患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对15例CMS患者（CMS组）和15例正常人（对照组）骨髓MSCs进行分离培养,于倒置显微镜下观察MSCs形态,用流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,测定生长曲线。结果采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34、HLA—DR和CD20。CMS组MSCs增殖能力高于对照组（P〈0．01）,但传代率低于对照组（P〈0．05）,对P3代细胞生长曲线进行观察发现CMS骨髓MSCs生长较对照组活跃。结论CMS患者骨髓MSCs在体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,CMS患者骨髓MSCs具有其特有的生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。