中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

目的研究中药复方牛黄、西洋参（简称牛黄参）含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰（MTT）比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的最佳浓度,蛋白印迹法（western blot）检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达的影响。结果牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调（P〈0.01）;能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达（P〈0.01）。结论牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础。     

四逆散含药血清诱导大鼠肝脏干细胞分化及其调控机制

目的: 研究四逆散含药血清对大鼠肝脏干细胞分化的影响并探讨其治疗肝病的作用机制。方法: 采用HPLC-MS-MS法,梯度洗脱,测定血清中四逆散的有效成分;以四逆散含药血清处理WB-F344细胞后,采用CCK-8法观察细胞增殖情况,血糖仪检测细胞培养液葡萄糖含量,乳酸测定试剂盒检测细胞中乳酸含量,荧光素荧光素酶法检测ATP含量,蛋白质印迹法观察表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor, FGFR)、转化生长因子受体(transforming growth factor beta receptor type Ⅰ, TGF-βRⅠ)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)蛋白表达情况。结果：在四逆散血清中,检测到以原型入血芍药苷、橙皮苷等成分,并检测到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代谢物。各浓度含药血清作用WB-F344细胞48 h后,对细胞均无毒性作用,10%含药血清显示出较好的促进细胞增殖的效果。随着药物血清作用时间的延长,WB-F344细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量降低,ATP生成增加,EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表达水平上升。结论：四逆散含药血清能够促进肝脏干细胞WB-F344的增殖并诱导其分化,分化机制可能与影响数种细胞因子受体的表达有关。     

健脾益气化瘀解毒方含药血清对结肠癌 HCT116细胞增殖、周期、凋亡的影响

目的探讨健脾益气化瘀解毒方含药血清对人结肠癌HCT116细胞增殖、周期、凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),凋亡相关蛋白Bcl-x L和Bax蛋白表达的影响。方法 10%、15%、20%健脾益气化瘀解毒方含药血清处理HCT116细胞12、24、48、72 h后,MTT法检测细胞增殖;不同浓度含药血清处理24、48 h后,碘化丙啶染色法检测细胞周期及凋亡率。蛋白质印迹法(Western blot)检测HCT116细胞内Caspase-3,Bcl-x L和Bax蛋白的表达;对照组均予以相同浓度空白鼠血清及10%胎牛血清(FBS)。结果细胞增殖:12 h后15%、20%含药血清与相同浓度鼠空白组比较,对HC116细胞的抑制作用具有统计学意义(P0.05),72 h对HCT116细胞的抑制作用最强(P0.05),健脾益气化瘀解毒方含药血清对HCT116细胞增殖具有良好的抑制作用,并与时间、浓度呈正相关。细胞周期:10%及15%含药血清组G2期细胞减少,而G1期与S期细胞增多,20%含药血清组G1期与S期细胞减少,而G2期细胞增加,48 h作用明显,而空白鼠血清细胞周期则无明显变化,说明含药血清能阻滞细胞周期,与时间呈正相关。细胞凋亡:与相应浓度对照组比较,含药血清处理24、48 h后,HCT116细胞晚期凋亡率增加,并且随浓度、时间增加凋亡率增加(P0.05),说明含药血清能促使HCT116细胞凋亡,与时间、浓度呈正相关。Western blot检测显示,与空白鼠血清组相比,15%含药血清可上调Bax蛋白表达,下调Caspase-3、Bcl-x L的蛋白表达(P0.05)。结论健脾益气化瘀解毒方可能通过将结肠癌HCT116细胞周期阻滞,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,通过上调凋亡相关蛋白Bax,下调Caspase-3、Bcl-x L蛋白的表达诱导细胞凋亡。     

调肝益气通络方促进骨髓间充质干细胞体外增殖研究

目的：探索调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖能力的影响。方法：腹腔注射＂CCl4-橄榄油＂混悬液制备WISTAR大鼠（35只）肝纤维化模型;其中30只灌胃给予调肝益气通络方（低、中、高剂量）1个月,制备含药血清;另外5只用于MSC细胞的分离与培养;用含药血清诱导MSC向肝细胞的分化连续14d;在各检测点进行形态学观察通过MTT对细胞增殖情况进行评价,通过WesternBlot检测诱导第7天、第14天甲胎蛋白的表达程度。结果：各浓度含药血清在加入1~14d后,其细胞数量均比常规培养组增多,并同用药剂量、时间呈正比;诱导14d后高剂量组甲胎蛋白呈强阳性表达。结论：调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力具有显著的促进作用,并可促进甲胎蛋白的分泌。     

益气化痰散瘀方含药血清对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察益气化痰散瘀方含药血清对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡的影响,并探讨其机制是否通过线粒体途径。方法制备益气化痰散瘀方含药血清和空白血清。组织贴块法培养大鼠PASMCs并进行a-SMA细胞免疫荧光鉴定。MTT法筛选最佳含药血清及最佳低氧时间:常氧对照组,低氧模型组,5%含药血清、10%含药血清、20%含药血清组(含药血清用空白血清稀释),分别作用12、24、48 h。正式实验根据MTT结果分为常氧对照组、低氧模型组、最佳含药血清组,含药血清作用最佳低氧时间后,TUNEL-FITC/DAPI法检测各组PASMCs凋亡情况,Western Blot法检测各组casepase-9、casepase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果 MTT结果显示益气化痰散瘀方含药血清浓度为20%、低氧作用24 h时抑制作用最强,效果最佳。TUNEL-FITC/DAPI法显示与低氧模型组比较,益气化痰散瘀方含药血清可明显促进低氧条件下大鼠PASMCs的凋亡(P0.01);Western Blot法显示益气化痰散瘀方含药血清可升高低氧大鼠PASMCs的casepase-9、casepase-3和Bax蛋白表达(P0.05,P0.01),降低Bcl-2蛋白表达(P0.01)。结论益气化痰散瘀方含药血清可能通过线粒体途径诱导低氧大鼠PASMCs凋亡。     

下瘀血汤抑制肝癌细胞生长的研究*

目的：研究下瘀血汤对肝癌HepG2细胞生长的影响,并初步探讨其作用机制。方法：选取对数期生长阶段的HepG2细胞,分别加入不含药血清、10%含药血清、20%含药血清,通过CCK-8法检测下瘀血汤含药血清对Hep-G2细胞的增殖影响;通过流式细胞仪（FCM）检测下瘀血汤含药血清对Hep-G2细胞的凋亡和周期的影响;通过PCR及Western-blot检测下瘀血汤含药血清对核仁纺锤体相关蛋白1（nucleolar spindle-associated pretein 1,NuSAP1）的抑制作用。结果：通过CCK-8实验,发现10%、20%含药血清在48小时（P<0.05）及72小时（P<0.01）均能够明显抑制HepG2细胞的增殖;细胞周期实验发现,10%及20%含药血清能够抑制HepG2细胞的增殖,使细胞阻滞于S期及G2期,差异具有统计学意义（P<0.05）,且具有浓度依赖的特点（P<0.05）;流式细胞技术检测凋亡结果显示不同浓度含药血清均能够促进HepG2细胞的凋亡,并且具有浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。通过PCR及Western-blot实验发现,10%及20%含药血清均能够抑制NuSAP1 mRNA及蛋白水平的表达,并随着含药血清的浓度增加,这一作用更为明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：下瘀血汤含药血清可能通过抑制Nusap1表达来抑制Hep-G2细胞的增殖及周期,促进其凋亡,下瘀血汤有望成为治疗肝细胞肝癌的有效中药。     

骨形态发生蛋白-4对肝干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对大鼠肝干细胞系WB-F344的增殖及分化的影响.方法:采用50 ng/mL的基因重组BMP-4作用于WB-F344细胞,以BMP-4拮抗剂Noggin(200 ng/mL)阻断BMP-4的作用为对照.在实验不同时间点,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测BMP-4对WB-F...     

补中益气汤含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察补中益气汤含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的影响,探讨补中益气汤治疗肿瘤的机制。方法：以补中益气汤给大鼠灌胃,腹主动脉采血并制备血清。MTT法检测含药血清对肺癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定肺癌细胞细胞凋亡。结果：补中益气汤不同浓度含药血清组与空白对照组比较均可明显抑制肺癌细胞体外增殖,差异有统计学意义（ P<0.05）;补中益气汤不同浓度含药血清组Lewis肺癌细胞凋亡率与空白对照组比较,明显升高,且随着含药血清浓度的增加,细胞凋亡率明显上升,具有浓度依赖性。结论：补中益气汤含药血清对肺癌细胞体外增殖有明显的抑制作用,且可促进肿瘤细胞凋亡。     

加味六君子汤含药血清对胃癌细胞BGC-823增殖和凋亡的影响

目的:观察加味六君子汤含药血清对胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法:以加味六君子汤不同浓度含药血清培养BGC-823细胞后,以MTT法检测对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化。结果:浓度为10%、15%、20%、30%、40%的含药血清作用于BGC-823细胞24、48、72小时后,细胞存活率显著降低,且与时间和剂量呈依赖关系。浓度为10%、15%、20%的含药血清作用于BGC-823细胞24小时后,G2期细胞增多,S期细胞减少。加药组BGC-823细胞凋亡率分别为(13.27±0.88)%、(19.97±0.60)%和(33.09±0.58)%,与空白对照组相同浓度空白血清细胞凋亡率(0.34±0.02)%、(0.19±0.04)%和(0.18±0.03)%比较,差异均有统计学意义(P0.01)。结论:加味六君子汤含药血清对BGC-823细胞生长有明显抑制作用,并可诱导BGC-823细胞凋亡。     

黄芪解毒汤对乳腺癌细胞凋亡及Notch1基因表达的影响

目的:观察黄芪解毒汤对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡及Notch1基因表达的影响,探讨该方抑制乳腺癌复发转移的可能机制。方法:制备含药血清,分为黄芪解毒汤血清组、阿霉素血清组、参一胶囊血清组,另设生理盐水血清组。常规培养细胞,MTT法检测不同浓度含药血清对MCF-7细胞增殖的影响;选择最佳抑制浓度的含药血清分别干预乳腺癌细胞,干预3 d后流式细胞仪检测各组MCF-7细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测各组MCF-7细胞Notch1基因的表达。结果:MTT法检测结果显示,3种含药血清均可抑制MCF-7细胞增殖(P0.05)且对细胞抑制最佳浓度为20%含药血清。流式细胞检测结果显示,与生理盐水血清组比较,黄芪解毒汤血清组、参一胶囊血清组、阿霉素血清组均可明显诱导MCF-7细胞凋亡(P0.05);实时荧光定量PCR结果显示,与生理盐水血清组比较,黄芪解毒汤血清组、参一胶囊血清组、阿霉素血清组Notch1基因表达均明显降低(P0.05)。结论:黄芪解毒汤可能通过诱导MCF-7凋亡、降低Notch1基因表达起到抑制乳腺癌复发转移的作用。     

郁金含药血清对HSC-T6细胞增殖抑制作用的影响

目的:观察郁金含药血清对肝星状细胞-T6(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)细胞增殖抑制的研究。方法:25只SD大鼠随机分5组:郁金含药血清高剂量组、中剂量组、低剂量组(16.2 g·kg-1、8.1 g·kg-1、4.0 g·kg-1),秋水仙碱组(5g·kg-1)以及空白组(给予等体积生理盐水),连续灌胃给药4 d后,于第4天一次性给药1 h后,乙醚麻醉腹主动脉取血制备含药血清;将HSC-T6细胞分为6组,郁金含药血清高剂量组、中剂量组、低剂量组,空白组、秋水仙碱组、阴性对照组(加入等体积的PBS代替大鼠血清),分别取用体积分数5%、10%、20%的含药血清,同时作用于各组HSC-T6细胞24 h、48 h、72 h后,采用四氮噻唑蓝法在酶标仪(490 nm波长)上检测各组OD值,分别计算其增殖率和抑制率。结果:与阴性对照组比较,除作用24 h、体积分数5%组外,大鼠血清可以明显加速HSC-T6细胞的增殖速度,其增殖率与大鼠血清含量呈正相关。与空白组比较,除作用24 h、体积分数5%含药血清各剂量组、低剂量20%组以及秋水仙碱20%组没有明显抑制作用外,其余各郁金剂量组均有增殖抑制作用,其中体积分数10%组的抑制效果明显高于体积分数20%组(P0.05)。作用48 h后,各干预含药血清的3个浓度组均有明显抑制作用,其中郁金体积分数10%组的抑制效果明显高于其他体积分数组(P0.05);作用72 h后,除秋水仙碱组外,各郁金剂量组均有明显抑制作用,其中含药血清体积分数10%组的抑制效果明显高于其他体积分数组(P0.01)。结论:大鼠郁金含药血清可以明显加速HSC-T6细胞的增殖;郁金含药血清在体外可以有效抑制HSC-T6细胞的增殖,但抑制率与含药血清体积分数、作用时间呈非线性关系,抑制率最为显著的是含药血清体积分数10%,作用时间48 h。     

肝素联合肝干细胞经脾移植治疗SD大鼠急性肝损伤

目的:探讨肝素联合肝干细胞(WB-F344细胞)经脾移植对大鼠急性肝损伤的治疗作用.方法:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体,体外培养、扩增WB-F344细胞,携带GFP基因的慢病毒转染WB-F344细胞.通过腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立大鼠急性肝损伤模型,造模后24 h分别将1 mL含2×107个肝干...     

中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的探讨中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制及凋亡的作用。方法设立空白血清组及中药清毒栓组、保妇康栓组、西药安达芬组,以4%含药血清培养液作用于SiHa细胞,分为3个时间点,通过MTT法检测各组对细胞增殖抑制的影响;同时运用流式细胞分析技术进行TUNEL法检测晚期细胞凋亡的变化。结果经含药血清培养液作用后各组SiHa细胞数量减少,其中以作用72h时对细胞抑制作用最强,与空白血清组比较,差异有统计学意义(P<0.01),且抑制作用安达芬组>清毒栓组>保妇康组,清毒栓组与安达芬组间差异有统计学意义(P<0.05)。各含药血清组对细胞凋亡均有显著的影响,且明显优于空白血清组(P<0.05),各含药血清组凋亡率依次为清毒栓组>保妇康组>安达芬组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论清毒栓含药血清通过促进细胞凋亡而达到抑制肿瘤的目的。     

白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖影响的实验研究

目的：观察中药白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖的影响。方法：取1月龄的SD大鼠膝关节关节软骨Ⅱ型胶原酶消化,建立软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色鉴定后,取体外培养第3代软骨细胞随机分为6组,分别加入不同浓度空白血清（5％、10％、15％）,不同浓度白附片含药血清（5％、10％、15％）,继续培养24、48、72h后,采用MTT比色法检测软骨细胞增殖的变化。结果：白附片含药血清组吸光度值（OD值）显著高于空白血清组,两组比较,差异有非常显著性意义（P＜0．01）。结论：白附片含药血清能有效促进大鼠膝关节软骨细胞的增殖。     

Effect of You-Gui Yin on glucocorticoid-induced apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells

Objective: To investigate the effect of You-Gui Yin on glucocorticoid-induced apoptosis of rat bone marrow mesenchymal stem cells and its possible mechanism. Methods: 20 SD rats were divided into normal saline group and You-Gui Yin group. Ten rats in each group were given normal saline and You-Gui Yin by gavage for 2 weeks, once daily. After the gavage, the rats were sacrificed by spinal removal, blood was taken from the abdominal aorta and centrifuged to obtain blank serum and medicated serum. The rat bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and cultured and administered in groups: blank group (10％ blank serum) , Model group (10％ blank serum + dexamethasone 5×10-5mol/ml), traditional Chinese medicine group (10％ medicated serum + dexamethasone 5×10-5mol/ml), control group (10％ medicated serum), CCK-8 method was used to detect cell proliferation changes in different groups, ELISA method was used to detect bone alkaline phosphatase levels in each group, Alizarin red staining was used to compare red-stained calcium mineralized nodules in each group, Western Blot Detect the expression of apoptosis-related proteins in BMSCs, and perform molecular docking of the quantitative components to evaluate the binding strength and activity of the target and the active compound. Results: The ratio of absorbance (A450) in each time period of the model group was significantly reduced (P<0.05), and the ratio of absorbance (A450) between the traditional Chinese medicine group and the control group was significantly higher than that of the model group (P<0.05). There was no difference between the control group and the blank group (P>0.05); ELISA method showed that the ALP level of the model group was significantly lower than that of the blank group and the control group (P<0.05), the traditional Chinese medicine group significantly increased the ALP level (P<0.05), there was no significant difference between the control group and the blank group; Observation of the number of calcium mineralized nodules under alizarin red staining microscope suggests that the number of calcium mineralized nodules in the model group is significantly lower than that of each group, and there is no significant difference between the control group and the blank group. Both groups are higher than the model group and traditional Chinese medicine Group; Western Blot indicated that compared with the blank group, the expression levels of pro-apoptotic proteins Bax and Cleaved-casepase-3 in the model group were significantly increased (P<0.01), and the expression levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 were decreased (P<0.01), on the contrary in the traditional Chinese medicine group, the expression of the control group did not change significantly compared with the blank group; the molecular docking results showed that You-Gui Yin mainly regulates the apoptosis of BMSCs through Epicatechin 5,7,3'-trimethyl ether, Delphinin, etc. promote bone formation. Conclusion: You-Gui Yin medicated serum can protect BMSCs from apoptosis induced by GCs and promote BMSCs proliferation and osteogenic differentiation by regulating Bax, Cleaved-caspase3, and Bcl-2.     

补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察不同浓度补阳还五汤(BYHWD)含药血清对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)增殖和迁移影响。方法补阳还五汤灌胃SD大鼠后腹主动脉取血,制备含药血清;体外培养人脑微血管内皮细胞(HBMECs),随机分为空白组(正常大鼠血清)及补阳还五汤含药血清组,血清浓度分为5%、10%和20%3个浓度,共6组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HBMECs增殖;细胞划痕法检测HBMECs迁移的相对距离。结果与空白组比较,5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖,差异有统计学意义(0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67±0.05,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少,差异有统计学意义(0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05,P0.05)。与空白组比较,各含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加,差异有统计学意义(0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53±0.05比0.45±0.04,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小,差异有统计学意义(0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03,P0.05)。结论补阳还五汤含药血清可促进HBMECs增殖和迁移,10%含药血清作用最佳。