兔肌源性干细胞的分离及诱导分化为成骨细胞的观察

目的:探讨兔肌源性干细胞的分离、鉴定和诱导分化的方法。方法:取2月龄幼兔臀肌1g,采用胶原酶,dispase,胰蛋白酶分步消化,针头过滤,差速贴壁法分离肌源性细胞。用锥虫蓝染色细胞计数描记生长曲线,MTT法间接反映细胞增殖活性。作Bcl-2,Desmin免疫细胞化学染色鉴定肌源性细胞。用分化培养基(DMEM+5mL/LFBS+50mL/LHS+10mg/LBMP2+5g/L维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10mg/L地塞米松+10g/L青霉素/链霉素)诱导细胞分化,用Osteocalcin,碱性磷酸酶,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定成骨前体细胞。结果:用上述方法分离的肌源性细胞呈短梭形或多角形,体积明显小于肌细胞,24h贴壁,接种后36h开始增殖,生长有明显的方向性,原代肌源性干细胞对数生长期为7～9d,16d汇合。第3代肌源性干细胞接种后第3～5天为对数生长期,约8d汇合。细胞汇合后少部分细胞出现双核或三核,甚至出现核链,显示肌细胞分化倾向。约60%～70%的原代肌源性干细胞Bcl-2,Desmin免疫细胞化学染色呈阳性。用成骨细胞分化培养基中培养2周后,大部分细胞Osteocalcin,碱性磷酸酶,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性,显示其成骨前体细胞分化。结论:用上述方法分离的肌源性细胞具有干细胞特征,并能在体外分化为成骨前体细胞和肌起源细胞,是一种组织特异性干细胞,即肌     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

目的：探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性，掌握其分离、培养及鉴定方法，了解其生长规律并进行体内定位。 方法：实验于2004-01／2005—10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只，切断小鼠双侧坐骨神经．造成失神经损伤模型。采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞，进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态，通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。 结果：①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性：失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢，1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形，成簇状生长。7-10d后大部分为梭形和多形状，细胞间相互出现成片融合，此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制：细胞培养前3d细胞生长慢，3d后生长明显加快．7d后生长明显放慢，进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定：细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性，细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位：CD34和Sea-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间，细胞小，细胞数量较少。 结论：采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞，体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力，适用于组织工程和基因治疗。     

差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

目的:探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性,掌握其分离、培养及鉴定方法,了解其生长规律并进行体内定位。方法:实验于2004-01/2005-10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只,切断小鼠双侧坐骨神经,造成失神经损伤模型。采用XI型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性:失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢,1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形,成簇状生长。7～10d后大部分为梭形和多形状,细胞间相互出现成片融合,此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制:细胞培养前3d细胞生长慢,3d后生长明显加快,7d后生长明显放慢,进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定:细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性,细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位:CD34和Sca-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间,细胞小,细胞数量较少。结论:采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞,体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力,适用于组织工程和基因治疗。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记肌源性干细胞:最佳浓度及时间

背景:肌源性干细胞移植入动物体内可以修复骨、肌肉、软骨或神经系统的损伤,但要了解其在体内的迁移、增殖及分化的情况,还需要一种有效、安全的标记方法来追踪其在体内的变化.目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞的效果,探讨其最佳标记浓度和时间.方法:采用差速贴壁法体外分离SD大鼠肌源性干细胞,免疫细胞化学染色法鉴定第2代细胞并进行细胞计数.以终浓度5,10,15,20 μmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞,检测其最佳标记浓度,免疫细胞化学染色法分析其标记率;通过MTT法、锥虫蓝排斥实验观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷对细胞增殖的影响.结果与结论:免疫细胞化学染色显示肌源性干细胞呈Desmin阳性,阳性率为(85.7±6.0)%;经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的肌源性干细胞与未进行标记细胞在活力和增殖上相比未见明显差异(P > 0.05),标记后的肌源性干细胞活细胞率可达(92.3±2.1)%.其中浓度为10,15,20 μmol/L标记组标记效果均优于5 μmol/L标记组,10 μmol/L为最佳工作浓度,最佳标记时间为3 d,标记率为(70.9±4.5)%,随时间延长无明显变化.证实应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞后,对细胞的活力及增殖情况无影响,标记率也能达到细胞移植对其示踪的要求.     

大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养

背景:要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节.目的:拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法.方法:成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用Ⅺ型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢.传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109L-1密度接种时活细胞数量最多,为适宜接种密度,传1～4代细胞生长状态良好.免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sea-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增.     

黄体酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞实验研究

目的：体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，黄体酮定向诱导。MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄体酮诱导3h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的：建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术；观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法：分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织，经消化及机械吹打后，用悬浮培养的方法，获得细胞克隆；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆；用免疫细胞化学方法，鉴定神经干细胞。结果：从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力；原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性；单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

新生大鼠骨源性间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化

目的 探讨体外培养的骨源性间充质干细胞向神经元样细胞的分化。方法 采用体外骨植块法培养骨源性的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），传代。用含0．5mmol／L IBMX，GDNF（10nG/ml）和IL-1β（100gpg／ml），中脑神经胶质细胞条件培养基和中脑神经膜碎片诱导其向多巴胺能神经元样细胞分化，免疫细胞化学检测神经细胞的表面标志NSE、MAP-2和TH。结果 原代骨源性间充质干细胞含有多种细胞形态，传代后细胞成均一的梭形。诱导前，对照组少量细胞表达NSE，不表达MAP-2和TH。诱导后间充质干细胞分化成表达NSE、MAP-2和TH的细胞。结论 骨源性间充质干细胞分化成神经元样细胞，表明其可跨胚层分化，同时为细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供一种新的细胞来源。     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的：从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆，对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定．检测所分离细胞群的增殖分化特性。 方法：实验于2005-07／10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只，利用神经于细胞条件培养基和单细胞克隆技术，从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后，以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。 结果：实验选用昆明种新生24h内小鼠12只，全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化：神经干细胞以神经球的方式悬浮生长。无明显突起，原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满，活力状态好，绝大多数在1d内贴壁，并从细胞球边缘伸出突起，加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化，克隆球周围有细胞移出，7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果：原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色。证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性；细胞经BrdU标记后，行BrdU免疫细胞化学染色，部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定：对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测，表达均呈阳性。 结论：成功分离并获得新生小鼠脑海马神经于细胞，该细胞可连续传代，具备多向分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

【目的】建立兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、纯化及鉴定方法,观察体外成骨潜能。【方法】应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的M SCs ,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,流式细胞仪检测细胞表型,所得的细胞进行成骨诱导分化后进行碱性磷酸酶（alkaline phos‐phatase ,ALP）染色及茜素红染色鉴定,并对成骨分化指标进行检测。【结果】原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形,漩涡状排列。传代后增殖迅速,细胞为单一的梭形,排列更加有序。培养的细胞CD44呈阳性表达,而CD34呈阴性表达。成骨诱导后ALP染色和茜素红染色均呈阳性。诱导组成骨分化后成骨标志物含量较对照组明显要高。【结论】密度梯度离心结合贴壁的方法可以获得高纯度MSCs ,增殖旺盛,体外具有成骨潜能。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的:建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术;观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法:分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织,经消化及机械吹打后,用悬浮培养的方法,获得细胞克隆;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆;用免疫细胞化学方法,鉴定神经干细胞。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力;原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力,是属于中枢神经系统的干细胞。     

诱导人眼轮匝肌来源肌源干细胞向许旺细胞样细胞的分化

背景:肌源干细胞的优越性引导学者们尝试从人眼轮匝肌中分离该细胞,同时进行许旺细胞方向的诱导分化,为周围神经的修复提供新的种子细胞来源。目的:诱导人肌源干细胞向具有许旺细胞特性的细胞分化。方法:①收集重睑成形术中切除的上睑眼轮匝肌,经酶消化和细胞筛过滤,贴壁培养分离人肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色。②取大鼠坐骨神经分离培养许旺细胞,收集许旺细胞条件培养液。③将人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,观察转化细胞的形态和免疫组织化学染色的变化。结果与结论:①原代培养4周时可见人肌源干细胞,与传代培养之人肌源干细胞同样呈现明显的小圆形形态,折光性强,少量细胞呈现短梭形。所有人肌源干细胞表现为 Desmin 阳性,Sca-1 染色阳性。②分离培养大鼠坐骨神经来源许旺细胞S100染色阳性率为(97.4±0.7)%。③经与许旺细胞条件培养液共培养,人肌源干细胞分化后细胞表达许旺细胞特异标记物S100,GFAP和p75。结果提示分离获得人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,可以诱导人肌源干细胞表达许旺细胞特异标记物,初步证实了人肌源干细胞可分化为许旺细胞样细胞。     

诱导人眼轮匝肌来源肌源干细胞向许旺细胞样细胞的分化

背景：肌源干细胞的优越性引导学者们尝试从人眼轮匝肌中分离该细胞,同时进行许旺细胞方向的诱导分化,为周围神经的修复提供新的种子细胞来源。目的：诱导人肌源干细胞向具有许旺细胞特性的细胞分化。方法：①收集重睑成形术中切除的上睑眼轮匝肌,经酶消化和细胞筛过滤,贴壁培养分离人肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色。②取大鼠坐骨神经分离培养许旺细胞,收集许旺细胞条件培养液。③将人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,观察转化细胞的形态和免疫组织化学染色的变化。结果与结论：①原代培养4周时可见人肌源干细胞,与传代培养之人肌源干细胞同样呈现明显的小圆形形态,折光性强,少量细胞呈现短梭形。所有人肌源干细胞表现为 Desmin 阳性,Sca-1 染色阳性。②分离培养大鼠坐骨神经来源许旺细胞S100染色阳性率为（97.4±0.7）%。③经与许旺细胞条件培养液共培养,人肌源干细胞分化后细胞表达许旺细胞特异标记物S100,GFAP和p75。结果提示分离获得人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,可以诱导人肌源干细胞表达许旺细胞特异标记物,初步证实了人肌源干细胞可分化为许旺细胞样细胞。     

不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响

本研究观察不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响。采用3％及6％明胶浓度沉降脐血红细胞并观察分离效果；应用Ficoll及Percoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，观察其对人脐血源黏附细胞48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、细胞培养成功率的影响，倒置显微镜观察细胞形态及生长状况，用细胞化学、免疫细胞化学进行细胞鉴定。结果显示，6％明胶浓度对红细胞沉降效果明显好于3％的明胶。无论是48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、黏附细胞集落开始形成时间、集落数达最高的时间及细胞融合时间，还是细胞培养成功率，Percoll明显优于Ficoll；两种方法分离培养的人脐血源黏附细胞的形态、细胞化学染色及免疫细胞化学染色等生物学特征无差异。结论：6％明胶联合Percoll细胞分离液是理想的人脐血源黏附细胞原代培养分离方法，本研究为人脐血源黏附细胞在临床的早日应用提供了基础信息。     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的:从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆,对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定,检测所分离细胞群的增殖分化特性。方法:实验于2005-07/10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只,利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后,以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。结果:实验选用昆明种新生24h内小鼠12只,全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化:神经干细胞以神经球的方式悬浮生长,无明显突起,原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满,活力状态好,绝大多数在1d内贴壁,并从细胞球边缘伸出突起,加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化,克隆球周围有细胞移出,7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果:原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色,证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性;细胞经BrdU标记后,行BrdU免疫细胞化学染色,部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定:对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测,表达均呈阳性。结论:成功分离并获得新生小鼠脑海马神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能。     

人类皮肤来源前体细胞的表型和特征

背景：研究证实,从人类的皮肤中成功分离出皮肤源性前体细胞并在体外长期培养,可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞以及具有周围神经元表型的细胞和许旺细胞。目的：进一步证实人皮肤组织来源的多能干细胞的培养方法和多方向分化能力,尤其向神经细胞、成骨细胞分化的可能性。方法：采用胰蛋白酶消化法培养人皮肤组织来源的前体细胞,应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。取三四代的细胞分别进行神经元诱导分化、成骨细胞诱导分化、yonKossa法钙染色、软骨细胞诱导分化、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色及苏丹黑染色。观察皮肤来源的前体细胞巢蛋白、波形蛋白、βⅢ管蛋白、S100及Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：用胰蛋白酶消化法培养出人皮肤组织来源的前体细胞,增殖聚集能够形成悬浮的细胞球,在培养的不同时间都可检测到巢蛋白阳性的细胞。培养的全部细胞表达波形蛋白,在贴壁的细胞中也能检测到βⅢ管蛋白的表达。利用丹参诱导皮肤源性前体细胞向神经元样细胞分化,表达神经细胞的标志物。应用成骨细胞诱导,yonKossa染色发现培养皿中有黑色的钙化结节产生,说明皮肤源性前体细胞能够分化为成骨细胞;将皮肤源性前体细胞向软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色强阳性,部分细胞表达Ⅱ型胶原,证明分化的细胞中含有软骨细胞。实验结果证实,皮肤中存在的多能干细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、许旺细胞和少突胶质细胞。     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景：肌源性干细胞是一种成体多能干细胞，已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点，临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的：探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法，为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计：重复观察测量。单位：武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料：实验于2003-12／2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只，XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸（Sigma公司），dispase酶（Gibco公司），鸡胚提取液（自制）。方法：①将大鼠以质量浓度为10异／L的戊巴比妥钠30s／ks腹腔麻醉后，无菌条件下取腓肠肌，置人冷DMEM培养基中，D—Hank’s液洗涤组织块，除去筋膜、肌腱、神经和血管。剪成1．0-3．0mm^3小块，移入离心管。向组织中加入0．2％XI型胶原酶及0．1％的胰酶。采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中孵育1h，未贴壁细胞移人新的培养瓶中，加入新的培养基37℃培养1h后，未贴壁细胞再次转瓶换液，37℃培养过夜，如此反复，每次间隔24h转瓶换液，培养第5-6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70％融合后，胰蛋白酶消化，以1：2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基，24h后制备细胞爬片，采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标：肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果：①肌源性干细胞的形态观察：从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形，折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形，48h后贴壁完全并开始增生，细胞逐渐延展成梭形或纺锤形，有两极，体积小。随培养时间的延长，细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果：细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光。阳性率达90％。结论：肌原性干细胞属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点O高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取．免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。