核因子-кB诱骗寡核苷酸增强阿霉素对肝癌耐药细胞化疗敏感性的机制

目的研究核因子(NF)-кB诱骗(decoy)寡核苷酸对肝癌耐药细胞株HepG2／阿霉素(ADM)化疗敏感性的影响及其内在机制。方法培养肝癌耐药细胞株,转染FITC标记的NF-кB decoy寡核苷酸,通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行核内定位的观察,凝胶迁移率实验检测转染前后NF-кB结合活性的变化,加入ADM,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,采用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡,观察转染NF-кB decoy寡核苷酸后肝癌耐药细胞对化疗药物的敏感性变化,DEVD-pNA降解法检测Caspase-3的活性变化,Western blot检测bcl-2蛋白表达的变化。结果转染荧光标记的NF-кB decoy寡核苷酸1 h,倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜显示定位于细胞核内,凝胶阻滞分析实验(EMSA)分析示NF-кB decoy寡核苷酸能够降低NF-кB核内结合,加入化疗ADM(0．1 mg/L)后,ADM作用24 h后出现细胞凋亡,流式细胞术、TUNEL法检测NF-кB decoy寡核苷酸转染HepG2／ADM细胞的凋亡,与对照组相比,凋亡指数增加,Caspase-3的活性增加,bcl-2的表达下调。结论NF-кB decoy寡核苷酸转染肝癌耐药细胞株HepG2／ADM后,能够抑制NF-кB的激活,Caspase-3活性增加和bcl-2的表达下调是其增加化疗药物的敏感性的可能机制。     

核因子-κB诱骗寡核苷酸增强阿霉素对肝癌耐药细胞化疗敏感性的机制

目的 研究核因子（NF）-κB诱骗（decoy）寡核苷酸对肝癌耐药细胞株HepG2／阿霉素（ADM）化疗敏感性的影响及其内在机制。方法培养肝癌耐药细胞株，转染FITC标记的NF-κB decoy寡核苷酸，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行核内定位的观察，凝胶迁移率实验检测转染前后NF-κB结合活性的变化，加入ADM，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖，采用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡，观察转染NF-κB decoy寡核苷酸后肝癌耐药细胞对化疗药物的敏感性变化，DEVD-pNA降解法检测Caspase-3的活性变化，Western blot检测bcl-2蛋白表达的变化。结果转染荧光标记的NF-κB decoy寡核苷酸1h，倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜显示定位于细胞核内，凝胶阻滞分析实验（EMSA）分析示NF-κB decoy寡核苷酸能够降低NF-κB核内结合，加入化疗ADM（0.1mg／L）后，ADM作用24h后出现细胞凋亡，流式细胞术、TUNEL法检测NF-κBdecoy寡核苷酸转染HepG2／ADM细胞的凋亡，与对照组相比，凋亡指数增加，Caspase-3的活性增加，bcl-2的表达下调。结论 NF-κB decoy寡核苷酸转染肝癌耐药细胞株HepG2／ADM后，能够抑制NF-κB的激活，Caspase-3活性增加和bcl-2的表达下调是其增加化疗药物的敏感性的可能机制。     

葛根素抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡

目的观察葛根素对吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度葛根素(0.01-100μmol/L)和吡格列酮(20μmol/L)作用于MC3T3-E1细胞24 h后细胞增殖活性影响。流式细胞仪测定葛根素和吡格列酮对MC3T3-E细胞凋亡的影响。Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达情况。结果 1、与对照组相比,吡格列酮组的细胞增殖活性明显下降(P0.05),而0.1-10μmol/L葛根素组细胞增殖活性明显增强(P0.05)。2、与吡格列酮组相比,加入0.1-1μmol/L葛根素后细胞的增殖活性明显增强(P0.05)。3、加入1μmol/L的葛根素后,吡格列酮导致的细胞凋亡率上升受到抑制(P0.05)。4、吡格列酮处理后caspase-3、caspase-8、Bax蛋白的表达上调,Bcl-2蛋白的表达下调,而加入葛根素共同作用后,caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白的表达上调。结论葛根素可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。     

骨形成蛋白2诱导肝癌细胞凋亡及其机制

目的观察骨形成蛋白2（BMP-2）诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的作用及机制。方法以ELISA法检测BMP-2诱导HepG2细胞凋亡，并以Westernblot法检测BMP-2处理后Bcl-2和Fas抗原的表达变化。结果1～100ng／mL浓度BMP-2均对HepG2细胞有诱导凋亡的作用，并能下调Bcl-2的表达量，同时增加Fas抗原的表达。结论BMP-2可诱导HepG2肝癌细胞凋亡，其机制可能是通过Fas介导的途径。     

NF-κB decoy寡核苷酸增强阿霉素对肝癌耐药细胞株HepG2/ADM化疗敏感性的研究

目的研究NF-κB decoy寡核苷酸增强肝癌耐药细胞株HepG2／ADM对阿霉素化疗敏感性的变化。方法通过培养液中阿霉素(adriamycin，ADM)的浓度梯度增加法，长期筛选培养，建立肝癌HepG2／ADM耐药细胞株，荧光定量PCR检测MDRl的表达，转染FITC标记的NF-κB decoy寡核苷酸，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行核内定位的观察，凝胶迁移率实验检测转染前后NF-κB结合活性的变化，加入化疗药物阿霉素(ADM)，MTT比色法检测细胞增殖，细胞凋亡采用流式细胞仪和TUNEL法检测观察转染NF-κB decoy寡核苷酸后肝癌耐药细胞对化疗药物的敏感性变化。结果HepG2／ADM细胞是一个明确的多药耐药细胞模型，转染荧光标记的NF-κB decoy寡核苷酸1h，倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜显示定位于细胞核内，凝胶阻滞分析实验(electrophoreretic mobility shift assay，EMSA)分析示NF-κB decoy寡核苷酸能够降低NF-κB核内结合，加入化疗ADM(0．1mg／L)后，MTT显示HepG2／ADM细胞的增殖明显抑制，ADM作用24h后出现细胞凋亡，流式细胞术、TUNEL法检测NF-κB decoy寡核苷酸转染HepG2／ADM细胞诱导的凋亡，与对照组相比，凋亡指数增加。结论NF-κB decoy寡核苷酸转染肝癌耐药细胞株HepG2／ADM后，能够抑制NF-κB的激活，逆转耐药细胞对化疗药物的耐受，增加其对化疗药物的敏感性。     

曲格列酮对肝癌HepG2细胞生长和分化的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ激动剂曲格列酮对肝癌HepG2细胞生长和分化的影响.方法 以曲格列酮处理体外培养的肝癌HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,分化标记物E-钙黏蛋白和清蛋白分别用免疫细胞化学和溴甲酚绿法检测,化学发光法检测肿瘤标记物AFP.Western blot检测细胞周期蛋白Dl、c-myc蛋白的表达.结果 曲格列酮以浓度依赖性方式抑制肝癌细胞生长,使细胞周期明显阻滞于G0/G1,并诱导E-钙黏蛋白表达.经曲格列酮处理后,清蛋白分泌量显著增加,AFP明显下降,细胞周期蛋白Dl、c-myc蛋白表达水平下降.结论 曲格列酮可诱导肝癌细胞分化,抑制其生长,其机制可能涉及下调细胞周期蛋白D1和c-myc蛋白表达.     

FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸的实验研究

目的:研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法:用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas、FasL的表达及Jurkat细胞表面Fas的表达;用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法,研究FasL诱导T细胞凋亡的功能;用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞,并通过检测细胞表面FasL表达、RTPCR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果:①HepG2.2.15细胞低表达Fas,却表达有功能的FasL,与高表达Fas的Jurkat细胞共培养可诱导后者凋亡;②肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后,FasLmRNA降低;细胞表面FasL表达下降;与Jurkat细胞共培养,Jurkat细胞的凋亡率下降。结论:肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能,是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一;FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。     

LIGHT／INF—γ基因配比转染HepG2细胞对其凋亡及Fas／FasL系统表达的影响

目的：观察脂质体介导的LIGHT和IFN—γ配比转染HepG2细胞后对其凋亡及Fas和FasL表达的影响。方法：将HepG2细胞分为LIGHT单独转染组、LIGHT和IFN—γ联合转染组和空白对照组，以脂质体为中介转染HepG2细胞；分别于转染后12、24和48h收集HepG2细胞，流式细胞术检测转染后HepG2细胞的凋亡率及Fas和FasL的表达。结果：LIGHT基因转染HepG2细胞能明显促进其凋亡，随时间延长凋亡率增加；Fas和FasL在HepG2细胞高表达，以Fas升高程度显著。结论：LIGHT和IFN—γ联合转染HepG2，其凋亡效果优于LIGHT单独转染，主要是通过上调Fas的表达来促进HepG2细胞凋亡。     

替格列扎对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨替格列扎对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响。方法:通过MTT法检测细胞的增殖,分光光度法检测细胞MDA表达和SOD活性;ELISA检测细胞上清中的MCP-1和IL-8水平;Real-time PCR及Western blot分别检测Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。结果:游离脂肪酸呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖,并使细胞Bax的蛋白表达的显著上升,Bcl-2的蛋白表达显著下降。替格列扎的加入显著减轻游离脂肪酸对HK-2细胞增殖的抑制作用,并使细胞Bax的mRNA与蛋白表达下降,而Bcl-2的mRNA与蛋白的表达上升。同时细胞SOD表达水平上升,MDA的表达水平下降;炎症介质MCP-1和IL-8表达水平均下降。结论:游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。替格列扎可通过减少氧化应激,抑制炎症反应,上调Bcl-2以及下调Bax的表达来抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡,从而减少其的肾毒性。     

康莱特诱导人肝癌细胞HepG2 凋亡的实验研究

目的 探讨康莱特注射液(KLT)诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制.方法 用不同浓度的KLT培养肝癌细胞HepG2,应用流式细胞仪检测HepG2凋亡细胞的发生,应用ELISA法检测相关凋亡蛋白Bcl-2的变化.结果 流式细胞术证实KLT可诱导肝癌细胞HepG2凋亡(P＜0.01), 且具有时间、剂量依赖关系.KLT处理组HepG2细胞中Bcl-2蛋白的表达分别为(16.91±0.20)units/ml、(10.78±1.41)units/ml和(7.66±0.64)units/ml,对照组为(22.65±2.83)units/ml.结论 KLT可诱导肝癌细胞HepG2凋亡;且KLT诱导HepG2细胞凋亡过程中,Bcl-2蛋白表达的下调对调控细胞凋亡有重要作用.     

细胞内稳态S-腺苷甲硫氨酸浓度对人肝细胞生长因子促肝癌细胞增殖效应中的影响

目的 观察细胞内稳态S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平的变化对人肝细胞生长因子(HGF)促肝癌细胞增殖效应的影响.方法 采用pGCSIL-GFP-MAT2AsiRNA重组质粒转染HepG2细胞升高细胞内SAM浓度,SAM竞争抑制剂C3-Ado降低SAM浓度,用RP-HPLC验证不同SAM浓度的细胞体系,并用噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)检测各细胞体系中的HGF促增殖效应.结果 HGF处理的HepG2细胞转染重组质粒后细胞内SAM浓度升高至(1.35±0.06)nmol/mg蛋白质,细胞增殖活性降低,G0/G1期细胞增加23.42%,G2/M期细胞减少40.61%,细胞凋亡率34.58%;当加入C3-Ado,细胞内SAM浓度下降至(0.37±0.03)nmol/mg蛋白质,细胞增殖活性升高,G0/G1期细胞减少7.73%,G2/M期细胞增加18.18%,细胞凋亡率5.17%.结论 HGF在肝癌细胞中发挥促有丝分裂效应的必要条件是肝癌细胞内稳态SAM浓度处于较低水平.     

Bcl-2家族蛋白在Ad．mda-7介导HepG2细胞凋亡中的变化

目的 观察Bcl-2家族蛋白在Ad．mda-7介导HepG2细胞凋亡中的变化，初步探讨Ad．mda-7介导肝癌细胞的凋亡机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒转染HepG2和ID2，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTr）及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞HepG2和正常肝胚细胞ID2的生长抑制和杀伤作用。AnnexinV和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Bcl-2家族蛋白的变化。结果Ad．mda-7能明显抑制肝癌细胞HepG2的生长，但对正常肝胚细胞ID2没有明显抑制增殖作用。Hoechst染色和流式细胞仪提示Ad．mda-7能明显诱导肝癌细胞HepG2细胞的凋亡，但对正常肝胚细胞ID2没有明显毒副作用。Westernblot说明抑制凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达在HepG2明显下降，在ID2中则没有变化；而促凋亡蛋白Bax在HepG2和ID2都升高。结论Ad．mda-7转染HepG2后，促凋亡（Bax）与抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xl）的比率发生改变，进而发生凋亡。     

他莫昔芬与γ-干扰素联合抗人乳腺癌细胞株的作用及其机制研究

目的: 探讨他莫昔芬(TAM)与 γ-干扰素(γ-IFN)联合抗乳腺癌细胞株的作用及其机制。方法:在体外培养条件下，分别或联合应用γ-IFN,TAM或雌二醇（E2）作用于ER阳性的MCF-7人乳腺癌细胞株，用MTT比色法分析细胞生长抑制作用;用流式细胞仪（FCM）检测细胞周期分布、凋亡率及用药前后Bcl-2,Bax,Fas,FasL及Caspase-8蛋白的变化;荧光分光光度仪检测Caspase-3活性。结果:TAM能抑制ER阳性乳腺癌细胞的生长，阻滞细胞周期于G0/G1期，并可诱导细胞凋亡;同时，TAM能拮抗外源性雌激素对MCF-7细胞的促生长作用。γ-IFN预处理细胞24h后，TAM抗乳腺癌细胞的作用增强。联用γ-IFN与TAM后，细胞Bcl-2蛋白表达下调，Caspase-8表达上调;但药物处理前后，细胞Bax，Fas，FasL蛋白表达水平及Caspase-3活性未见明显变化。结论:体外条件下，TAM通过影响细胞周期、诱导细胞凋亡而发挥抗ER阳性乳腺癌细胞作用;γ-IFN能加强TAM的抗乳腺癌作用。两者作用机制可能系通过下调Bcl-2表达和上调Caspase-8的表达。     

Multiple anticancer effects of blocking MEK-ERK signaling in hepatocellular carcinoma

BACKGROUND: Human hepatocellular carcinoma (HCC) is associated with increased expression and activity of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling intermediates (ie, MEK, ERK). STUDY DESIGN: We determined the effects of MEK-ERK signaling on proliferation, cell cycle, apoptosis, and tumorigenicity of HCC in vitro. HCC cell lines were treated with MEK enzyme-specific inhibitors, PD098059 and U0126, and ERK1,2 oligonucleotide antisense. RESULTS: In the HCC cells examined, MEK inhibitors blocked ERK1,2 phosphorylation without a change in total ERK expression. ERK1,2 oligonucleotide antisense inhibited ERK1,2 protein expression. PD098059, U0126, and ERK1,2 oligonucleotide antisense each inhibited HCC cellular proliferation in a concentration-dependent manner. Cell cycle, apoptosis, and tumorigenicity were examined in Hep3B and HepG2 cell lines. MEK enzyme inhibition resulted in anticancer effects through cell cycle arrest, increased apoptosis, and decreased tumorigenicity in these cell lines. U0126 exhibited more potent inhibition of ERK1,2 phosphorylation and had more pronounced anticancer effects in both cell lines. Correspondingly, HepG2 cells, the cell line more sensitive to ERK1,2 phosphorylation inhibition, sustained more pronounced anticancer effects with treatment. But Hep3B cells were more sensitive to ERK1,2 antisense-mediated decreases in ERK1,2 protein expression and correspondingly, their growth was inhibited to a greater degree than the HepG2 cells. MEK enzyme inhibition had downstream effects on the expression of the antiapoptotic protein survivin in both cell lines. CONCLUSIONS: These data suggest that there are multiple anticancer effects of blocking MEK-ERK signaling, and that these depend on both the susceptibility of the cells and the ability of the treatment to effect a selective block of MEK-ERK signaling in HCC cells.     

下调PAR基因表达对前列腺癌PC3细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的影响

目的:本研究以RNA干扰技术下调PAR(prostate androgen regulated)基因表达,探讨其对前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡及其相关蛋白Bcl-2/Bax表达水平的影响。方法:PC3细胞转染靶向PAR基因的siRNA,MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果:PC3细胞PAR基因表达水平下调,此时处于G2-M期的细胞增加,为(29.95±3.25)%;细胞凋亡率亦明显增加,为(20.61±2.73)%,与对照组比较差异有显著性意义(P<0.01),同时Bcl-2蛋白表达下降,Bax表达水平升高,Bax/Bcl-2比值升高。结论:PAR基因表达下调可诱导细胞G2-M期阻滞和凋亡,其机制为抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达,同时促进Bax表达。     

矢车菊素-3-葡萄糖苷诱导人胃癌细胞株SGC7901凋亡及其机制

目的 观察矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)在体外诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的生物学效应,并初步探讨其分子机制.方法 分别采用不同浓度梯度的C3G处理SGC7901胃癌细胞,MTT比色法检测细胞生长率;激光共聚焦显微镜观察细胞形态改变;TUNEL法分析细胞凋亡率;Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、ICAD蛋白表达的情况.结果 C3G在体外能明显抑制人胃癌SGC7901细胞的生长增殖,且呈浓度、时间依赖性(P＜0.01).激光共聚焦显微镜下可见Hoechst33258荧光染色细胞呈凋亡特征性改变;TUNEL法检测实验组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组(P＜0.01);C3G可下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,降低Bcl-2/Bax蛋白的比值,促使Caspase-3酶原蛋白活化,下调ICAD蛋白表达(P＜0.01).结论 C3G具有在体外抑制胃癌细胞增殖的作用,并能诱导其凋亡,其机制可能与Bcl-2/Bax降低导致Caspase-3活化、ICAD蛋白表达下降相关.     

重组腺相关病毒介导的MDA-7基因对人肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应

目的 探讨PEG启动子调控腺相关病人毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7对肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应.方法 以重组腺相关病人毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统感染人肝癌细胞株HepG2细胞和正常人肝细胞株LO2细胞,Westerm Blot检测转染细胞内MDA-7蛋白,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞周期、Annexin-Ⅴ、线粒体跨膜电位(△Ψm),RT-PCR检测bcl-2基因mRNA.结果 重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA7可特异性转染HepG2细胞,MDA7蛋白在HepG2细胞中高效表达,并呈时间依赖性;重组腺相关病毒rAAV-PEC-MDA-7可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,从24 h开始Annexin-Ⅴ阳性细胞比例增多,△Ψm降低,抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达降低.而重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7对LO2细胞无类似效应.结论 构建出的重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统可选择性抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导凋亡机制受到bcl-2家族经线粒体途径的调节.     

刺参黏多糖诱导人肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察刺参酸性黏多糖(SJAMP)体外诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的情况,并初步探讨SJAMP对HepG2细胞中Bcl-2和nm23-H1表达有何作用,为其能否应用于肝癌的临床治疗提供理论依据和可行性评估.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2,用不同浓度的刺参黏多糖(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0g/L)培养人肝癌细胞HepG2.采用细胞毒试验(MTT法)检测HepG2细胞抑制率,蛋白印迹法(western blot)检测相关蛋白Bcl-2和nm23-H1 的变化. 结果 (1)MTT细胞毒试验证实SJAMP能明显抑制人肝癌细胞HepG2细胞的生长,且呈时间和浓度依赖性.(2)western blot试验中,与空白组相比,SJAMP处理组、对照组(5-FU)及共同作用组HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达均明显降低(P<0.05),nm23-H1蛋白的表达则明显升高(P<0.05). 结论 (1)SJAMP可通过抑制细胞增生并诱导凋亡来抑制人肝癌细胞HepG2的生长;(2)SJAMP可诱导人HepG2细胞中Bcl-2和nm23-H1蛋白含量的改变来发挥其抗肿瘤作用.