激活蛋白-1与p53基因启动子结合的染色质免疫沉淀技术分析

目的 检测肺腺癌A549细胞内的转录因子激活蛋白-1(AP-1)与p53基因调控区的结合情况.方法 采用染色质免疫沉淀技术,用c-jun特异性抗体沉淀DNA,聚合酶链反应(PCR)技术检测p53基因5'端特异性序列.结果 在c-jun特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p53 5'端的特异性序列.结论 AP-1在A549细胞内结合于p53基因的调控区,参与该基因的表达调控.     

碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠,为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代小鼠耳缘组织于EP管中,用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR扩增COX-1和COX-2基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定,即野生型（COX-1＋/＋;COX-2＋/＋）、杂合子（COX-1＋/-;COX-2＋/-）和纯合子（COX-1-/-;COX-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法,并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。     

饮水中有机致突物对小鼠体细胞遗传损伤的分子机制研究

通过居家饮水中提取的有机浓缩物亚急性染毒小鼠后,在动物肝、肾、肠组织观察到显微病理及超微病理学变化;各实验组小鼠胸骨骨髓嗜多染红细胞微核率高于阴性对照组。用PCR- SSCP方法可检出高剂量组肝、肾、肠组织DNA p53基因点突变,尤以第7外显子突变频率较高。提示用分子生物学技术研究饮水有机致突物在实验小鼠体内遗传毒性机制的可行性     

固体垃圾和渗沥液中总DNA提取及微生物多样性分析

基于对生活垃圾及其渗沥液提取总DNA方法的评价,采用ARDRA和RISA分析固体垃圾和渗沥液的生物多样性.通过总DNA浓度、纯度、片段分布情况、PCR扩增等指标评价,找出效果较好的提取方法,该法从固体垃圾和渗沥液中均获得了高质量的总DNA,DNA分子片段在23 kb左右,且样品不需经过纯化可以直接进行PCR扩增;ARDRA和RISA分析显示固体垃圾比渗沥液具有更丰富的微生物多样性.     

筛选肝细胞p53启动子结合蛋白的噬菌体表面展示技术

目的 筛选p53启动子结合蛋白,探讨p53对肝细胞调节的分子生物学机制.方法 应用噬菌体表面展示技术,以p53作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果 噬菌体经5轮富集后,成功构建了噬菌体p5...     

小鼠ScFv基因片段的构建

目的 利用分子重组技术构建小鼠单链抗体片段(ScFv)。方法 采用PCR反应从小鼠脾细胞扩增鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区，利用连结引物将重链和轻链DNA组装成单链抗体(ScFv)片段。结果 克隆出VH，VL基因，用Linker将VH，VL连接起来后的ScFv构建成功，其分子量为750bp。结论 ScFv分子小，异源性低，可以结合与噬菌体载体中形成融合蛋白表达．该技术是抗体制备的一种简便、可靠的方法。     

RT-PCR诊断风疹及E1膜蛋白基因序列分析

目的：应用RT－PCR方法扩增风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片为检测该病毒感染的靶目标。方法：对发疹后4周，ELISA检测风疹病毒感染（IgA阳性）的病人血清样品提取RNA，用RT－PCR方法扩增风疹病毒E1膜蛋白的142bp核苷酸片段。测序并与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列进行比较，结果：10份样品中，4份样品扩增到一条DNA片段，测序结果分析表明3份样品扩增的风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片段序列与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列有3个核苷酸的差异，一份样品扩增的风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片段序列与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列4个核苷酸的差异。结论：该片段的核苷酸序列很稳定，适用于作为RT－PCR方法检测该病毒感的靶目标。     

转基因食品DNA提取技术研究

目的：建立从食品中提取DNA的方法。方法：采用CTAB法、酶裂解法、SDS沉淀法3种方法提取转基因相关食品中的：DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸的纯度和浓度、PCR扩增真核生物的18S rDNA基因评价提取核酸的质量。用转基因植物通常含有的CaMV35S启动子作为转基因成分的指示标记。结果：3种方法得到的DNA提取物OD260／OD280比值均接近1．6-1．9，CTAB法获得的DNA量较少，酶提取法所得的DNA提取物的量多，但扩增条带荧光较暗。SDS法能收获较多的DNA，PCR扩增效果好。用SDS法提取的DNA进行35S启动子检测，3份转基因样品均出现强阳性结果，而10份非转基因食品均未产生阳性条带。结论：SDS沉淀法提取DNA，具有经济、简便的特点，所提的DNA量适用于PCR检测。     

从德国小蠊干标本中提取基因组DNA可行性的研究

目的拟建立用现场采集到的以及饲养过程中德国小蠊死亡后,晾干样本提取基因组DNA的方法。方法从现场环境中采集死亡的、体形较为完整的德国小蠊,晾干后,采用6种预处理方法后进行后续提取,并对所得基因组DNA质量进行吸光度、电泳与PCR扩增检测。结果从现场环境中采集到的德国小蠊干标本中获得了较高质量的基因组DNA,OD_(260/280)值可在1. 8～2. 0之间,1. 5%琼脂糖凝胶电泳在15 000 bp处有明显条带。以提取到的基因组DNA为模板可扩增出438 bp的β-actin基因和超过2 000 bp的钠离子通道基因VSSC片段。结论以本研究现场环境采集的体形较为完整的德国小蠊干标本为材料可以提取到基因组DNA,能满足至少2 000 bp的基因片段的PCR扩增要求,该方法在一定条件下有较强的可行性。     

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)和4个受体基因片段,构建酵母表达载体,为应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持。方法提取人血液中RNA,逆转录转为c DNA,PCR扩增TGF-β1和4个受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)基因片段,双酶切后,分别插入酵母双杂交表达载体p GBKT7和p GADT7;经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后,构建质粒p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡ-C和p GADT7-TβRⅡ-D。结果成功扩增TGF-β1基因(1 200 bp)和TβRⅡ-A(453bp)、TβRⅡ-B(366 bp)、TβRⅡ-C(276 bp)和TβRⅡ-D(165 bp)基因片段,经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确。结论成功构建p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡC和p GADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体。     

应用RDPCR技术检测饮用水有机浓集物对大鼠p53基因的损伤作用

目的 运用依赖随机化末端连接物聚合酶链式反应(RDPCR)技术检测环境中混合污染物的DNA损伤作用。方法 将水样有机浓集物腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝、肺、肾及白细胞的DNA,运用RDPCR技术检测其对大鼠p53基因外显子7的DNA损伤作用。结果 水样有机浓集物对大鼠的基因组DNA具有断裂作用;经RDPCR、杂交显色后在大鼠肝、肾组织中检测到了杂交条带,而血及肺组织中未检测到杂交条带。结论 RDPCR技术可成功地运用于检测环境混合污染物。水样有机浓集物对大鼠p53基因外显子7具有DNA损伤作用,其主要靶器官为肝和肾。     

氯乙酸类饮水氯化消毒副产物对大鼠p53基因的损伤作用研究

目的检测二氯乙酸和三氯乙酸对大鼠p53基因的DNA损伤作用,证实其遗传毒性并探讨其致癌作用的分子机制。方法将二氯乙酸、三氯乙酸腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝组织DNA,应用依赖随机化末端连接物PCR技术检测其对大鼠p53基因外显子7的DNA损伤作用。结果在DCA染毒组检测出2条杂交条带,表明DCA可引起大鼠肝组织p53基因外显子7的损伤,有2个位点。未检测到TCA对大鼠p53基因的损伤作用。结论二氯乙酸的致癌作用可能与损伤p53基因有关,RDPCR技术检测靶组织p53基因的损伤作用与大鼠致癌试验的结果有很好的一致性。     

石英的人类致癌性在DNA分子水平的证据

收集３６例石英粉尘作业工人肺癌（石英肺癌）的组织石蜡包埋物,提取其 Ｄ Ｎ Ａ,对 ｐ５３基因和 Ｋ ｒａｓ 基因进行了 Ｐ Ｃ Ｒ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ、 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ及 Ｄ Ｎ Ａ 测序分析,发现具有完全有别于普通肺癌的特异基因突变谱。小细胞肺癌的 ｐ５３基因突变多发于第８外显子,腺癌的 ｐ５３基因突变率高。石英肺癌的 Ｋ ｒａｓ 基因突变未见一例发生于普通肺癌突变热点区第１２密码子上,相反发现多处非热点区突变,突变类型以 Ｇ→ Ｃ 突变为主。     

PCR-SSCP技术检测矽肺合并肺癌癌组织p53基因突变的研究

用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析法对３６例矽肺患者的石蜡包埋的原发性肺癌组织ｐ５３基因第５、７、８外显子进行了检测，检出突变１５例。突变在第５、７、８外显子上都有发生，但以第８外显子上发现的阳性突变最多。对肿瘤类型和ｐ５３基因突变的关系进行了分析，发现矽肺病例肺腺癌ｐ５３基因阳性突变率最高，为５３．９％，高于普通型肺癌（３３．０％）。进一步对其中１例样本进行核苷酸序列直接测定，结果显示第５外显子非突变热点区的第１４４位密码子核苷酸由ＣＡＧ突变为ＡＡＧ，氨基酸由谷氨酰胺突变为赖氨酸，以上结果与非职业肺癌明显不同，提示ｐ５３基因突变在矽肺病例肺癌发生中起着重要作用，可能与矽尘作业环境中含有的某些化学致癌物有关。     

p53-Bax线粒体凋亡通路DNA甲基化与胆管癌病理生物学的关系

目的探讨p53-Bax线粒体凋亡通路抑癌基因启动子区的甲基化状态与胆管癌病理生物学行为的关系。方法采用甲基化PCR检测36例胆管癌患者癌组织和癌旁组织中抑癌基因甲基化诱导静止基因（TMS1／ASC）、死亡相关蛋白激酶（DAPK）和p14启动子区甲基化状态,并对p53基因外显子5～8进行DNA测序,分析以上基因的突变与胆管癌生物学行为的关系。结果24例（66．7％）胆管癌患者癌组织中至少有1个抑癌基因启动子区存在甲基化,p14、DAPK和TMS1／ASC的甲基化率分别为25％、30．6％和36．1％。5例（13．9％）患者的癌旁组织中存在抑癌基因启动子区甲基化,其中TMS1／ASC启动子区甲基化3例（8．3％）,DAPK启动子区甲基化2例（5．6％）。DNA测序显示,22例（61．1％）胆管癌患者癌组织中p53基因外显子5～8存在突变。其中14例（38．9％）p53基因外显子突变伴1个以上抑癌基因启动子区甲基化,与胆管癌的病理类型、浸润深度、分化程度显著相关（P〈0．05）。抑癌基因非甲基化及p53突变阴性组（4例）术后1、2、3年的生存率分别为70％、43％、28％,抑癌基因甲基化及p53突变阳性组（14例）术后1、2、3年的生存率分别为28％、5％、0％,前者的生存率显著高于后者（X^2=9．060,P=0．03）。结论p53-Bax线粒体凋亡通路中抑癌基因启动子过甲基化是胆管癌组织中常见的分子事件,癌旁组织中TMS1／ASC和DAPK基因甲基化程度虽然较低,但可能对胆管癌有早期诊断意义。p53突变伴抑癌基因甲基化与胆管癌的病理生物学行为有关,趋向于较高的恶性程度和较低的生存率。     

食管癌与p53突变和人乳头状肉瘤病毒感染

目的探讨p53基因突变与人乳头状肉瘤病毒16（HPV16）感染在食管癌发病中的作用及相互关系。方法应用病例-病例研究方法进行分析，采用聚合酶链反应（PCR）、单链构像多态性（SSCP）、测序等分子生物学技术对110例食管癌组织标本中p53基因的突变与HPV16感染进行了检测。结果110例食管癌组织标本p53基因突变率为49．1％，其中外显exon5—6，exon7，exon8—9的突变率分别为19．1％，27．3％，17．2％。食管癌组织HPV16的检出率为49．1％。吸烟患者p53基因突变率（61．4％）明显高于非吸烟患者p53基因突变率（48．2％），差异有统计学意义；淋巴结转移患者p53基因突变率（65．2％）明显高于无淋巴结转移患者p53基因突变率（37．5％）；HPV16阳性者中，p53突变率是40．7％，HPV16阴性者仅为57．1％，两者差异无统计学意义。结论HPV16感染可能是食管癌高发区的危险因素；p53基因突变与吸烟、淋巴结转移有明显相关性；HPV16感染和p53基因突变可能是2个独立的事件。     

P53 mutations in hepatocellular carcinoma patients in Egypt

The p53 gene plays a major role in hepatocellular carcinoma (HCC). Acquired mutations may provide clues to etiology, as some carcinogenic agents are associated with specific genetic changes in p53. Our aim was to analyze the spectrum of p53 mutations in tumor tissues from subjects with HCC in Egypt, where there is a rising incidence of HCC due to hepatitis C virus (HCV). We collected tumor tissues from 41 subjects with HCC diagnosed at the National Cancer Institute of Cairo University during 2000-2003. Sequence mutations were analyzed by the Affymetrix GeneChip technique. HCV RNA was detected in the sera of 37 subjects (90%). Only one patient had a current HBV infection. A total of 17 of the 41 subjects (41%) had p53 mutations. Thirteen of these were in exon 7, of which 10 were in codon 249, but only 8 of the 10 were the R249S mutation, previously reported to be associated with aflatoxin exposure. The other three exon 7 mutations were found in codons 232, 242 and 248. A total of three mutations were detected in exon 5 codons 133, 144 and 176. One mutation was detected in exon 8 codon 275. Unlike previous studies, this population is characterized by a high prevalence of chronic HCV infection. The presence of the R249S mutation in exon 7 may indicate that these subjects with HCC have been exposed to aflatoxin (AFB1), and further investigation is in progress to measure AFB1-albumin adducts in the sera of these subjects.     

Assessment of the mutations of p53 suppressor gene and Ha- and Ki-ras oncogenes in malignant mesothelioma in relation to asbestos exposure: a study of 12 American patients

In our previous study, we found no genetic alteration in exons 1 and 2 of Ha- and Ki-ras oncogenes nor in exons 5 to 9 of the p53 suppressor gene in seven Japanese malignant mesothelioma patients exposed to asbestos. To examine further whether malignant mesothelioma due to asbestos has genetic alterations in the p53 suppressor gene and in Ha- and Ki-ras oncogenes, we analyzed point mutations of these genes in paraffin embedded operative open biopsied samples of the primary tumor of malignant mesothelioma in twelve American patients. The genetic analysis was conducted by the PCR-SSCP (polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism) method in all patients and by sequencing analysis of DNA bases in the two patients with suspected gene mutation. The analysis of the p53 suppressor gene showed an amino acid converting mutation of exon 7 in one patient and a polymorphism of exon 6 in another patient; the former patient was a heavy smoker with a biphasic cell type. No genetic alteration was found in exons 1 and 2 of Ha- and Ki-ras oncogenes in any of the patients. The results suggest that the effects of asbestos on the p53 suppressor gene and Ha- and Ki-ras oncogenes in malignant mesothelioma are negligible. Further studies are needed to examine whether the observed mutation of the p53 suppressor gene is due to the combined effects of asbestos and smoking or to other unknown factors.     

聚合酶链反应-单链构象多态法在研究新疆地方性砷中毒患者p53基因突变中的应用

目的 探索砷致癌的基因多态性,为进一步研究砷对人体健康作用的远期影响提供科学依据.方法 于2001年采集新疆奎屯123团4例经病理诊断为皮肤癌的砷中毒患者的6份皮肤癌石蜡包埋组织及其4份血液组织;采集奎屯128团2例经病理诊断为皮肤癌的砷中毒患者和2例癌前砷中毒患者的血液组织;采集对照区新疆奎屯125团2例健康居民的血液组织.采用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)银染术测定p53基因外显子(exon,E)5～9突变情况.结果 p53基因中,仅E6、E7发生突变.凝胶电泳成像显示,p53基因E6、E7有异常条带、条带缺失及条带上移现象.结论 砷对p53基因有致突变作用,突变位于E6、E7.