鼠痘病毒荧光定量Taqman-PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR检测方法, 以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选, 本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段, 作为引物设计位点设计引物和探针, 并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法, 对鼠痘病毒的检测极限是68 copies/μL;该方法特异性强, 只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增, 而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR方法, 该方法特异性强、灵敏度高, 且具有较好的稳定性和重复性, 具有广阔的应用价值。     

应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人丙型肝炎病毒（HCV）的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HCV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物先进行基因克隆,而后制备病毒样颗粒做为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达100IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可定性检测血浆或血清样本及血液制品中的人丙型肝炎病毒HCV的基因型及含量,对于该疾病的研究及临床治疗都具有重要的意义。     

Hcmv-miR-UL112荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速准确检测hcmv-miR-UL112的方法。方法根据miRBase网站中公布的hcmv-miRUL112基因序列,通过设计引物、探针及优化反应条件,建立了一种实时荧光定量PCR方法对hcmv-miR-UL112进行定量检测,并进行敏感度、重复性和特异性实验,同时对PCR产物进行测序验证。结果获得了1条特异性茎环反转录引物,一条特异性PCR正向引物和通用反向引物。PCR最佳反应条件为95℃10min,53℃2min;95℃15s,57℃40s,共40个循环。该方法的批内变异系数CV和批间CV均<5%,相关系数R2均>0.99,扩增效率均>90.0%。结论成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性好并且简便快速的hcmv-miR-UL112荧光定量qRT-PCR检测方法。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

荧光定量PCR检测细胞代谢综合征相关基因表达的优化

目的优化MRSG mRNA表达的Taqman荧光定量PCR检测反应体系并进行系统评价。方法设计荧光PCR适用的引物和探针,从模板、引物、探针、镁离子浓度等方面优化荧光定量PCR检测反应体系,评价优化系统的特异性和稳定性。结果确定系统的模板取样量为2μl,引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,Mg~（2＋）浓度为4mM,建立了稳定的MRSG mRNA表达的Taqman荧光PCR检测方法。结论优化后的MRSG mRNA荧光PCR检测方法特异性和稳定性较好。     

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立鼠痘病毒(ECTV)的TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测.方法 根据GenBank中鼠痘病毒的crmD基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定.结果 建立的ECTV ...     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10²copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。