流行性出血热病毒传代细胞双价纯化疫苗研究

目的我国的流行性出血热主要由汉滩型(HTN)和汉城型(SEO)病毒引起,疫苗的免疫接种是控制和预防本病发生的关键之举.现有的疫苗虽有较好的近期防病效果,但副反应多、抗体水平低,而且由于需要大量的动物种群以提供原代细胞的来源,造成环境污染而疫苗质量又难以控制.本专题的主要研究内容和目的就是用Vero细胞作为生产疫苗的基质,同时用现代较先进的浓缩纯化技术和检测手段,研制成精制双价疫苗.方法两型病毒分别在Vero细胞传代适应至高滴度,大量培养收获上清作为疫苗原液,采用超滤技术浓缩50～100倍,然后通过Sepharose4FF柱纯化.认真测定抗原和蛋白含量、牛血清含量、细胞DNA含量及必要的试验,精心配制成Vero双价疫苗.结果按我国"生物制品规程"和出血热灭活疫苗临床试验最低标准进行全面系统鉴定,完全符合质量要求.正待批准进行人体临床试验.结论本品有可能作为现有疫苗的替代品.     

转瓶培养非洲绿猴肾传代细胞生产纯化流行性乙型脑炎疫苗的研究

目的研究用１５Ｌ转瓶培养非洲绿猴肾传代细胞（Ｖｅｒｏ细胞）生产纯化流行性乙型脑炎（以下简称乙脑）疫苗的工艺,提高乙脑疫苗的质量。方法用１５Ｌ转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞和扩增乙脑病毒,病毒经过灭活、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、蔗糖密度梯度区带离心纯化,制备成冻干疫苗。结果建立了一套１５Ｌ转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞生产纯化乙脑疫苗的工艺,用此工艺制备三批冻干疫苗,经检定疫苗质量达到同类产品的国际水平,已通过新药审评,人体安全性和效果观察正在进行中。结论转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞生产纯化乙脑疫苗是可行的。     

DEAE-Sepharose FF 纯化脊髓灰质炎病毒Sabin株Ⅰ型稳定性研究

【摘要】 目的 观察离子交换纯化脊髓灰质炎病毒Ⅰ型Sabin株稳定性,以研究病毒纯化的回收率和质量控制。方法 使用微载体培养Vero细胞和脊灰病毒Ⅰ型Sabin株,经过逐级过滤澄清和100K超滤膜浓缩,再经凝胶介质初步纯化后的病毒液,然后观察经过离子介质DEAE Sepharose FF层析纯化5批次的纯化效果。对每次纯化获得的病毒液测定D抗原、蛋白质含量、牛血清白蛋白含量、DNA残留量以评价其质量。结果 凝胶纯化后的病毒液,经离子介质DEAE Sepharose FF纯化,其D抗原、蛋白质含量、牛血清白蛋白含量、DNA残留量和比活性的批间差异不显著(P＞005)。结论 离子介质DEAE Sepharose FF在一定批次内纯化脊灰病毒工艺稳定。     

儿童和老年人群接种双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)安全性观察

目的评价双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)应用于6～15岁及60岁以上人群的接种安全性。方法对知情同意的6岁以上三个年龄组500名健康人群按2∶1∶2的比例非随机接种双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞),采用同一批疫苗接种16～60岁人群作为对照组,观察6～15岁及60岁以上人群试验疫苗接种反应。结果6～15岁儿童组、16～60岁成人组在初次疫苗接种后中度全身(体温)反应率均为1.00%,6～15岁儿童组在初次疫苗接种后中度局部(局部红肿)反应率为0.50%;6～15岁儿童组、16～60岁成人组在第二次疫苗接种后没有观察到中、强度(体温、局部红肿)反应;>60岁老人组在初次和第二次疫苗接种后均没有发现中、强度反应。三组的全身、局部反应发生率均差异无显著性(P>0.05)。结论双价肾综征出血热纯化疫苗(Vero细胞)在6～15岁儿童组和>60岁老人组人群接种具有良好的安全性。     

冻干Vero细胞狂犬病纯化疫苗临床效果观察

目的观察国产冻干Vero细胞狂犬病纯化疫苗临床应用的免疫效果和安全性。方法选择犬致伤者240例．随机分为试验组和对照组。实验组接种冻干Vero细胞狂犬病纯化疫苗，对照组接种地鼠肾狂犬病纯化疫苗。两组人群均按照狂犬病疫苗暴露后常规免疫程序进行接种，于全程接种后15d检测中和抗体，并观察副反应。结果实验组抗体阳性率为96．7％，明显高于对照组的90．0％（P〈0．05）；副反应发生率为10．8％，明显低于对照组的21．7％（P〈0．05）。结论冻干Vero细胞纯化疫苗抗体阳转率高、副反应发生率低，临床应用优于地鼠肾纯化疫苗．适宜推广使用。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。     

聚丙烯酰胺凝胶碎块吸收法浓缩感染性病毒的效果观察

用聚丙烯酰胺凝胶(PAG)碎块吸收洗脱法,分别将腺病毒5型(AdV-5)感染的HeLa细胞培养液、疱疹病毒2型(HSV-Ⅱ)感染的原代乳兔肾(BRK)细胞和Vero细胞培养液浓缩100倍左右,其感染性病毒的回收率依次分别为78.5％、7％和1.6％。表明该法在浓缩腺病毒中影响病毒感染性较小,有实用价值;而对HSV-Ⅱ的感染性影响较大,其原因不清。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应

目的：探讨CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应。方法：培养Eca-109细胞,用酸洗法收集细胞膜表面小肽,再用去盐、浓缩、超滤法纯化这些小肽后,以此刺激人外周血树突状细胞（DC）作为人食管癌疫苗,不用小肽刺激的DC作为对照疫苗,并用这些疫苗加佐剂CpG基序激活纯化的T细胞。实验分组：①CpG基序加食管癌疫苗组（CpG—Ve）;②CpG基序加食管癌对照疫苗组（CpG—Vc）;③单纯食管癌疫苗组（Ve）;④单纯食管癌对照疫苗组（Vc）;⑤单纯CpG基序刺激组;⑥直接用纯化的T细胞加Eca-109细胞作效应对照组。用^3H渗入法对各组行T细胞增殖试验,用^51Cr释放试验测定各组细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。结果：CpG-Ve组的T细胞增殖活性和CTL对Eca-109细胞杀伤率均高于其余各组（P〈0．01）。结论：CpG基序可能是人食管癌疫苗研究中的有效佐剂。     

用生物反应器制备乙脑灭活疫苗的研究

目的 用生物反应器制备乙脑纯化灭活疫苗.方法 用搅拌式生物反应器培养Vero细胞,接种并培养乙型脑炎病毒,将收获的病毒液进行灭活和纯化.结果 细胞密度都增至2.4×106ml-1以上,病毒滴度都>7.25 lgLD50/ml.结论 用生物反应器制备乙脑灭活纯化疫苗的工艺合理,可以生产出高滴度的乙型脑炎病毒液.     

用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗

目的研究微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗。方法搅拌式生物反应器培养Vero细胞,待细胞在微载体上长成单层后,用狂犬病毒aG株感染细胞。培养5d后,开始灌流收获病毒液,每天取样测定病毒滴度。经灭活后制备成试验疫苗,进行效力试验。结果3次培养,细胞密度均达到1×106/ml以上,病毒滴度都在106LD50以上,3批试验疫苗的效价分别达到5.88、6.49和5.98IU/ml。结论在生物反应罐中用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗工艺合理,所获免疫原性良好,适用于工业化生产,有较好的应用前景。     

质谱法分析肠道病毒71型疫苗原液的主要蛋白成分

目的采用质谱法对我国2家进入临床试验肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗的主要蛋白成分进行分析和比较,为完善EV71疫苗的质控方法提供实验依据。方法应用梯度SDS-PAGE法对2家生产自Vero细胞的EV71疫苗原液（A、B原液）进行蛋白电泳分析,蛋白条带经切胶回收、脱色、胰酶酶切后提取蛋白多肽,采用液质联用仪（LC/MS）对回收的各条带蛋白多肽进行二级质谱序列测定。采用酶联免疫法（ELISA）和二喹啉甲酸法（BCA）分别检测浓缩后的疫苗原液中EV71抗原含量和总蛋白含量,计算比活值。结果将原液浓缩10余倍后经梯度SDS-PAGE电泳分析,抗原A为4条带,抗原B为6条带。采用质谱法检测各条带蛋白并搜库分析发现,各条带均含有EV71多聚蛋白;抗原A条带1、3和抗原B的条带1、3、4、5、6含有猴源蛋白。经PSMs（鉴定多肽次数）计算发现EV71蛋白占总蛋白比例分别为96.7%和95.0%,比活值为865.5、291.8U/μg。结论质谱法可作为疫苗中蛋白检测的辅助方法,并考虑在多批次检测的基础上提出限量要求,为疫苗质量的一致性提供保障。     

上海2株严重急性呼吸综合征冠状病毒2的分离与鉴定

目的 从新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者鼻/咽拭子样本中分离、培养严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。方法 将来自上海市COVID-19患者的3份鼻/咽拭子样本以TPCK胰酶处理,然后接种Vero E6细胞;待大部分细胞出现明显病变时,取细胞培养上清用qRT-PCR法检测病毒核酸,并用反转录PCR扩增病毒受体结合区（RBD）基因片段;将病毒扩增培养后感染接种于96孔板中的Vero E6细胞,观察细胞病变效应,并用免疫荧光法检测病毒蛋白。结果 2份COVID-19患者鼻/咽拭子样本接种的Vero E6细胞出现明显细胞病变效应,细胞培养上清中检测出新复制产生的SARS-CoV-2核酸,扩增出的RBD序列与早期分离出的SARS-CoV-2相应序列完全一致;病毒感染的Vero E6细胞病变迅速,并能与SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）单克隆抗体、刺突蛋白（S蛋白）单克隆抗体及COVID-19患者恢复期血清发生反应。结论 从2份COVID-19患者鼻/咽拭子样本中成功分离出SARS-CoV-2,为后续开展SARS-CoV-2感染与致病机制研究、防治药物与疫苗的研发奠定了基础。     

鸡胚成纤维细胞培养抗肿瘤NDV疫苗的实验研究

目的用细胞培养法研制高效价人用抗肿瘤NDV。方法采用鸡胚成纤维细胞低血清培养法,在接种NDV之前的细胞培养中,少量使用优质小牛血清（2%）,让单层细胞基本铺满培养瓶底时,用无血清培养液多次洗涤单层细胞,以尽量降低残余牛血清含量。接种NDV之后,以人白蛋白代替小牛血清继续滋养细胞,培养病毒。结果NDV收获液LogPFU≥5.5,血凝效价1：640,经反向间接血凝试验检测,残余牛血清蛋白含量≤50ng/ml。结论NDV效价和活性符合人用疫苗要求。     

酶免疫组化法对肾综合征出血热早期诊断的方法学研究

目的：用酶免疫组化法对肾综合征出血热进行早期诊断。方法：将肾综合征出血热病毒(HFRSV)接种于Vero—E6细胞，培养后制高效价病毒抗原片。应用酶免疫组化技术进行检测。结果：酶免疫组化技术对肾综合征出血热能早期、快速、特异性地诊断。结论：实验证明该法具有早期诊断、快速简便、特异敏感等特点，其检测结果可长期保存等优点，尤其适用于基层医疗单位推广应用。     

Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的不良反应和免疫效果观察

目的观察Vero细胞乙型脑炎（乙脑）纯化疫苗（Vero细胞乙脑疫苗）的不良反应和免疫效果。方法筛选8～20月龄无任何乙脑疫苗免疫史和1．5～3岁完成了Vero细胞乙脑疫苗基础免疫的二组健康婴幼儿为观察对象，接种Vero细胞乙脑疫苗后观察其接种不良反应，并在两组中随机抽取100名左右的对象检测免疫前和免疫后1个月血清乙脑中和抗体。结果Vero细胞乙脑疫苗接种不良反应总发生率为8．8％。发热反应总发生率为8．1％。其中，基础免疫接种第1剂后发热反应的发生率为6．5％，第2剂无发热反应；加强免疫发热反应发生率为9．6％。基础免疫后抗体阳性率为83．2％，抗体几何平均滴度（CMT）达1：25．1，免疫成功率为77．3％。1年后抗体阳性率为61．5％，GMT为1：19．0，加强免疫后抗体阳性率高达93．7％，GMT为1：32．4，免疫成功率为80．2％。结论Veto细胞乙脑疫苗安全、有效，值得在预防控制乙脑工作中大力推广使用。     

我国分离的流行性出血热Chen株病毒结构蛋白的组成

本文报告用从安徽省分离的流行性出血热Chen株病毒,同时和Hantaan病毒分别感染Vero E_6细胞,以免疫亲和层析提纯病毒,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)SDS-PAGE)分离病毒结构蛋白。观察到Chen株病毒和Hantaan病毒同样含有三种病毒结构蛋白,且电泳迁移率相似;三种病毒结构蛋白在病毒颗粒中各自存在独立的一级结构,病毒颗粒表面两种糖蛋白之间不存在双硫键的联结。     

从罗赛鼠及社鼠中分离出流行性出血热病毒及其抗原性鉴定

本文报告从流行性出血热疫区江西省宜丰县野外捕捉的罗赛鼠和社鼠中分离出两株流行性出血热(EHF)病毒。鼠肺标本冰冻切片,用 EHF 单克隆抗体免疫荧光染色反应阳性;接种 Vero—E6细胞,经 IFA、ELISA 及电镜检查,证实为 EHF 病毒;用十种 EHF 单克隆抗体对其抗原性进行了比较研究,结果表明新分离出的两株病毒其抗原性与家鼠型 EHF 代表株 R_(22)比较接近。     

兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）疫苗株AV41胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒（Vaccinia Virus，VV）晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点，经酶切、PCR鉴定出，命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸（bovine testes，BT）细胞，待出现80%以上的细胞病变时收获病毒，经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定，获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒，命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示，LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲本株相似，保持原有疫苗株的生长特性，而且在BT细胞和羔羊睾丸（lamb testes，LT）细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物，为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。     

双毒清治疗流行性出血热126例

双毒清治疗流行性出血热１２６例刘泽富何文革尚高峰白雪帆王俊涛周永兴（第四军医大学唐都医院传染病科西安７１００３８）关键词出血热，流行性双毒清治疗中图号Ｒ５１２．８双毒清具有清除病毒和清热解毒之功效［１］，１９９２年１月～１９９４年１２月治疗流行性出血...