抗癌胚抗原鼠人嵌合抗体重、轻链基因在昆虫细胞中的表达

本文采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf_9,秋粘虫细胞)中表达了抗癌胚抗原(CEA)鼠-人嵌合抗体重、轻链基因.将鼠源性单抗杂交瘤细胞中已克隆到的重、轻链可变区(V_H、Vk)基因分别与人免疫球蛋白恒定区基因Cr_3、Ck相拼接,构建鼠人嵌合抗体基因.含嵌合抗体基因的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf_9细胞,并通过点杂交、PCR扩增和Southern blot分析获得重组病毒.Western blot分析表明以重组病毒感染的Sf_9细胞分别表达了嵌合重链和轻链,放射免疫分析法(RIA)和间接ELISA测定的结果表明嵌合重、轻链基因表达产物具有与CEA结合的能力.     

抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制

目的：研制抗人肿瘤坏死因子(rTNF—α)嵌合抗体。方法：以具有中和TNF—α活性的鼠源性单抗(Z12)的轻、重链可变区基因，构建人—鼠嵌合抗体基因的表达载体，并转染COS7细胞。用RT—PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF—α活性实验，分别对瞬时表达的抗rTNF—α嵌合抗体(CZ12)的细胞培养上清进行检测：结果：①瞬时转染后，细胞系经RT—PCR检测有人—鼠嵌合抗体mRNA的转录：②ELISA和Western blot检测表明，CZ12与TNF—α产牛特异性反应，并识别相对分子质量(Mr)为17000的TNF—α。③竞争抑制实验中，CZ12能竞争抑制Z12与rTNF—α的特异惟结合，④体外中和实验汪实，CZ12能中和TNF—α对L929细胞的毒性。结论：成功地研制具有中和活性的人—鼠嵌合抗体CZ12。     

抗HTNV mAb 3G1单链抗体基因转化植物的研究

目的 构建抗HTNV mAb 3G1 scFv的转基因拟南芥植株.方法 从含有3G1 scFv基因的重组质粒中酶切获得含有该目的基因的表达框,将其克隆入载体pCAMBIA2301,构建植物表达载体3G1scFv-pCAMBIA2301.通过农杆菌介导的花粉管法将其转入拟南芥,PCR和Southern blotting检测是否获得转基因植株.组织化学染色检测标记基因GUS是否表达.结果 限制性内切酶酶切鉴定结果证明3G1 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pCAMBIA2301,构建获得3G1scFv-pCAMBIA2301重组质粒.PCR和Southern blotting检测证明获得抗HTNV mAb 3G1 scFv的转基因拟南芥植株.组织化学染色结果表明,标记基因亦高效表达.结论 成功地将外源基因转入拟南芥中并表达,为进一步研究利用植物表达医用抗体奠定了基础.     

抗炭疽保护性抗原人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的 在CHO细胞中表达抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)人-鼠嵌合抗体,并对其活性进行分析.方法 RT-PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻、重链可变区基因,分别与人Kappa型轻链恒定区、IgG1重链恒定区基因融合后构建了轻重链嵌合抗体基因.将轻重链嵌合抗体基因克隆表达载体上,构建了嵌合抗体的双启动子表达载体pSeeTag-5E1.将pSecTag-5E1转染CHO-dhfr(DG44)细胞,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高氨甲蝶呤(MTX)的浓度,筛选表达量高的克隆,扩大培养,收集上清,并纯化,用纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blot、抗原结合活性、体外细胞保护试验和动物试验.结果 在MTX的浓度为5×10~(-8)mol/L时,获得稳定表达细胞株,表达量为18 mg/L.结论 成功在CHO-dhfr(DG44)细胞中表达了具有中和活性的抗rPA人-鼠嵌合抗体,为制备抗炭疽的被动免疫制剂奠定了良好的基础.     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗RSV人-鼠嵌合抗体的构建及表达

用RT PCR法克隆抗RSV 鼠单抗4C2 的轻、重链可变区基因, 构建了轻、重链分别表达的载体pAG4622_4C2 和pAH4604 4C2, 及轻、重链同时表达的载体pdHL4C2, 分别转染SP2/0 细胞和DHFR- CHO细胞, 检测培养上清中的嵌合抗体表达。结果在pdHL4C2 转染的CHO 细胞中检测出了可与表达RSVG/F糖蛋白的143TK 细胞结合的人 鼠嵌合抗体     

细胞因子受体-嵌合抗体真核表达载体的构建

目的：构建细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体基因真核表达载体。方法：用RT-PCR方法从人胚肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因，并用限制性酶切连接方法拼接。用PCR方法从抗人AFP单链抗体表达载体中扩增VL、VH基因，分别与人kappa轻链和人gammal重链恒定区基因重组，获得人鼠嵌合轻链和重链，再将EpoR-gp130与嵌合重链连接，最后将嵌合轻链和H—EpoR-gp130分别连接到质粒pVITRO上，构建pVITRO-E-g-Ig载体。结果：获得EpoR胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp。重组真核表达载体经限制性酶切鉴定示EpoR、gp130基因、嵌合重链基因和嵌合轻链基因正确连接到载体pVITRO。结论：成功构建细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体基因表达载体。     

人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因在Sp2／0细胞中的初步表达

目的 在前期工作的基础上,进一步将人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因转染到鼠骨髓瘤细胞Sp2/0并进行初步表达。方法 将含人源性NHFRS本轻链基因的真核表达载体VkEpSV-neo,用脂质体法转染鼠骨髓瘤细胞Sp2/0,用RT－PCR法和免疫组化法染色法检测转染及表达结果。结果 RT－PCR和免疫组化染色结果表明人源性抗HFRS病毒抗轻链基因不仅已成功地转染进Sp2/0细胞,并得到了良好的表达。结论 在鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中成功表达人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因,对抗HFRS病毒抗体人源化的研究具有重要意义。     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

mTLR-2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的 :克隆mTLR 2基因 ,并在毕赤酵母中的表达其融合蛋白。方法 :采用RT PCR从鼠肝脏中扩增mTLR 2全基因 ,并将其克隆到T载体中 ,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPICZαC中 ,构建重组质粒 ,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR、RT PCR验证 ,表达的重组蛋白用SDS PAGE和Westernblot进行分析。结果 :克隆了mTLR 2全基因(AY179346 ) ,与已发表的mTLR 2基因的同源性为 99.84 %。构建了重组表达质粒pPICZ mTLR 2。SDS PAGE和Westernblot分析显示 ,在相对分子质量 (Mr)为约 970 0 0处出现 1条特异性蛋白带 ,且能与兔抗mTLR 2抗体发生反应。结论 :克隆了mTLR 2全基因 ,并在毕赤酵母中获得表达。     

戊型肝炎病毒结构区基因在大肠杆菌中的表达

目的获得可用于研制戊型肝炎疫苗的基因工程抗原。方法用非融合蛋白表达载体ｐＥＴ１１ａ,表达戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）第二读码框区（ＯＲＦ２）２２４６６０ａａ段蛋白。结果得到分子量为５００００的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实,表达产物具有ＨＥＶ特异抗原性。结论该基因工程抗原可能具有制备戊型肝炎疫苗的前景。     

轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因在花生中遗传转化的研究

为提高外源蛋白的表达量和简化分离纯化过程,使用植物油体表达载体,以花生子叶节为转化受体,通过农杆菌介导将轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因开展遗传转化的研究。从转化植株中随机选取11株表现Kan抗性植株进行PCR检测,结果有6株能扩增出特异性条带,阳性率为54.5%。对转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交分析,发现转基因植株中有6株PCR反应呈阳性,其中有3株PCR-Southern杂交有特异性目标带出现。结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上。该研究为以植物为载体生产廉价、高效的植物口服疫苗奠定了基础。     

Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors

PROBLEM : Sperm immobilizing antibodies cause infertility mainly through complement dependent sperm immobilization. To analyze any effect of sperm immobilizing antibody on fertilization, we had already established cell lines that secrete IgM monoclonal antibody (MAb H6-3C4) and IgG monoclonal antibody (MAb EnBCMGS). The latter was a class-switched recombinant IgG antibody that shares the same variable region as MAb H6-3C4. The biological effects of the IgG antibody were also reported previously to eliminate sperm immobilizing or sperm agglutinating activities. However, the method of chemical digestion of IgG had some disadvantage to prepare the purified Fab fragment stably and in large quantities. This time we report a unique method to obtain the recombinant Fab fragments (Fab EnBCMGS) using polymerase chain reaction (PCR) and cDNA expression vectors. METHOD : Two kinds of PCR primers were designed to make a truncated heavy chain (Fd) gene of MAb EnBCMGS. The amplified Fd gene and light chain gene were ligated into cDNA expression vectors and then transfected into mammalian cells. RESULTS : Expression of the Fd gene and light chain gene were confirmed by Northern blotting. Secretion of the recombinant Fab fragment from mammalian cells was also confirmed by Western blotting. The Fab fragment showed biological activity as is expected by FACS analysis. CONCLUSION : This method enables the stable production of genuine Fab fragments of IgG in mammalian cells without any chemical treatment that may be time consuming and affect the quality of the Fab fragments.     

鼠源轮状病毒vp7基因的表达载体构建及转基因植物的研究

目的：构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp7的植物表达载体及植物转化研究。方法：抗原基因vp7经PCR扩增后直接克隆到PUC－T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果：以重组农杆菌为介导将靶基因转入到马铃薯外植体。成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中；以农杆菌为介导获得抗性转基因马铃薯植株。结论：通过PCR检测，初步确定轮状病毒外壳蛋白基因vp7已成功地整合到马铃薯植株中。     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。