缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达

背景：国外已经有学者使用斑马鱼胚胎开始进行缺氧再灌注的研究,但还没有关于c-fos基因在斑马鱼脑缺氧再灌注过程中的表达及其作用机制的报道。目的：观察缺氧再灌注后斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及脑组织中c-fos基因的表达情况。方法：取48hpf的斑马鱼胚胎进行缺氧实验,模拟新生儿缺氧再灌注损伤环境,通过向水中通入99．999％高纯氮气制造缺氧环境,分别经过6,12,24h的缺氧处理后,在正常氧体积分数下进行6h恢复。对照组为正常通气组（溶解氧浓度在7．0mg／L左右）。采用吖啶橙染色方法,观察不同缺氧时间对斑马鱼神经细胞凋亡的影响,同时采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）,对c-fos基因表达情况进行定量分析,比较缺氧再灌注前后c-fos基因表达水平的变化。结果与结论：对照组脑部能检测到微量细胞凋亡,c-los基因呈低水平表达;实验组经过6,12,24h缺氧后,脑部凋亡细胞逐渐增多,缺氧24h组凋亡细胞增幅最大（尸〈0．05）,c-los基因表达有不同程度升高（P〈0．05）,尤其是缺氧6h后,该基因的表达上调幅度最高。结果表明缺氧会导致斑马鱼脑细胞内c-los基因表达上调,可能是导致缺氧后期脑细胞凋亡激增的机制之一。     

MAPK/ERK信号通路调节K562细胞中mdr1基因的诱导性表达

目的 观察多柔比星(doxorubicin,DOX)诱导K562细胞mdr1基因表达过程中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的作用,探讨mdr1基因的转录调控机制.方法 多柔比星初始浓度为0.01 μg/ml,诱导K562细胞24 h后撤药继续培养至细胞状态恢复,加入多柔比星继续诱导24 h,浓度增加为0.02μg/ml.依上述方法 多柔比星浓度逐渐增加,直至0.05μg/ml.收集DOX浓度为0.01、0.03和0.05μg/ml时的细胞.RT-PCR检测mdr1基因表达,流式细胞仪检测mdr1基因编码的P糖蛋白(P-gP)的表达,Western blot 检测ERK活化情况.MAPK的抑制剂PD98059预处理K562细胞1 h后与多柔比星共同作用,逆转录(RT)-PCR和流式细胞仪分别检测mdr1基因和P-gP的表达情况.结果 经多柔比星作用后K562细胞中ERK磷酸化增强,同时mdr1基因转录上调,及其蛋白产物P-gP的表达也增加,当多柔比星浓度为0.05μg/ml时两者的表达均增加了5倍之多.而用PD98059预处理细胞后能明显抑制多柔比星诱导mdr1基因转录和蛋白表达,多柔比星浓度为0.03μg/ml时PD98059对mdr1基因表达的抑制率为(74.1±0.11)%,多柔比星浓度为0.05 μg/ml时抑制率为(70.2±0.14)%.结论 多柔比星能够诱导K562细胞mdr1基因表达,同时激活MAPK/ERK信号通路,阻断ERK的活化能抑制mdr1基因的诱导性表达.     

急性外周神经损伤时大鼠c-fos和c-jun mRNA表达的时序性变化

目的：了解c-fos，c-jun mRNA在大鼠背根神经节细胞的表达情况，探讨急性外周神经损伤对大鼠背根神经节的c-fos，c-jun mRNA表达的影响。方法：建立大鼠的坐骨神经切断模型，利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法，检测急性外周神经损伤后，在不同的时间点(5，15，30，60，120min)大鼠的背根神经节的c-fos，c-jun mRNA表达。结果：损伤后5min损伤组与对照组间c-fos，c-jun表达[(0．51±0．18)％，(0．63±0．17)％]差异无显著性意义(P>0．05)。c-fos于损伤后30～120min表达为(1．41±0.22)％，(1．22±0.21)％，(0．98±0．17)％．与对照组比较，差异有显著性意义(P<0．05)；c-jun于损伤后15—120min表达为(0．63±0．17)％，(0．80±0.20)％，(1．47±0．17)％、(2．68±0．22)％，(1.60±0．18)％，与对照组比较，差异有显著性意义(P<0.05)。损伤后c-fos，c-jun mRNA表达逐渐升高，呈时间依赖性。结论：c-fos，c-jun是神经细胞损伤的敏感标志，急性外周神经损伤能引起c-fos，c-jun mRNA表达的时序性变化，为基因水平认识和防护外周神经损伤提供理论依据。     

三七皂苷对造血细胞AP-1家族转录调控蛋白NF-E2,c-jun和c-fos的诱导作用

为了进一步研究三七总皂苷(PNS)对转录调控蛋白AP-1家族的主要成员NF-E2、c-jun和c-fos转录因子的诱导作用，探讨PNS在造血细胞内的信号传递途径，选用人粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01 4个细胞株作靶细胞，经PNS刺激处理后提取细胞核蛋白，分别用人抗NF-E2、c-jun和c-fos抗体与核蛋白作Western blot杂交试验，并用^32P标记的具有与NF-E2、c-jun和c-fos转录因子共同结合位点的AP-1双链寡核苷酸探针作电泳带移动阻滞试验(EMSA)。结果表明：①western blot显示PNS诱导HL-60，K562，CHRF-288和Meg-01 4株细胞的NF-E2和c-jun转录因子蛋白水平分别是未经处理细胞的1．5-2．5倍和2．0—3．0倍。诱导的c-fos蛋白在K562，CHRF-288和Meg-01 3株细胞分别提高2．0—3．0倍，但HL-60细胞的c-fos在PNS处理后无明显变化；②EMSA显示AP-1转录调控蛋白与DNA结合复合物的特异性条带，经PNS诱导后4株细胞的AP-1蛋白与DNA复合物条带密度明显高于未经处理的细胞。结论：PNS在造血细胞内对基因的转录调控涉及到AP-1家族转录因子成员NF—E2、c—jun和c—fos，通过诱导这些转录因子量的增加，与特异性DNA促进子结合的活性增高而调控与细胞增殖分化相关的基因的表达。     

刺五加苷B对MPP~＋诱导PC12细胞损伤ERK通路的影响

目的观察刺五加苷B对MPP＋诱导损伤的PC12细胞ERK1/2蛋白及相关转录因子表达的影响,探究其神经保护作用机制。方法以MPP＋损伤的PC12细胞为模型组,以正常PC12细胞为对照组,Western blot法检测细胞ERK1/2表达及磷酸化水平,荧光定量PCR法检测c-fos和c-jun mRNA的表达水平。结果模型组ERK1/2磷酸化水平较对照组显著降低（P〈0.01）,c-fos和c-jun表达明显上调,差异有统计学意义;给予刺五加苷B（10mg·L-1）后,受损细胞ERK1/2的磷酸化水平明显升高,c-fos和c-jun基因的过表达水平降低。结论刺五加苷B对MPP＋诱导的PC12细胞损伤的保护作用机制可能与提高ERK1/2蛋白磷酸化水平,避免诱发c-fos和c-jun基因过表达有关。     

ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响

目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径。方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20μmol/L组。在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、pERK1/2蛋白表达。结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798)。溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.826、P=0.298)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P=0.001、P=0.002)。溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.370、P=0.351)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P0.001、P0.007)。结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达。Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程。     

大鼠脑挫裂伤后c-jun和c-fos基因快速反应的特点

背景：目前关于c-jun和c-fos基因表达的重要性已逐渐被人们认识，而关于脑挫伤后两种基因表达的特点报道较少。目的：探讨脑挫裂伤后c-jun和c-fos基因表达的特点。设计：随机对照实验研究。地点和材料：实验地点：原张家口医学院实验中心电镜室，成年Wistar大鼠45只，体质量200-310g。干预：将45只大鼠随机分为模型组、假手术组及正常对照组，正常组不做任何处理，假手术组开颅窗不进行打击，模型组大鼠以自由落体法复制脑挫伤模型，伤后30min，1，2，4，8，24，72h杀死大鼠取脑组织，石蜡切片，用PV6000免疫组织化学染色。主要观察指标：c-jun和c-fos基因蛋白表达的异同点。结果：正常对照组和假手术组c-fos无阳性表达，而c-jun呈弱阳性。模型组c-fos阳性神经元分布在伤灶周围区皮质1．0-2．0mm和同侧海马；c-jun阳性神经元在伤侧皮质和海马广泛分布，相邻脑片c-jun阳性细胞着色深，尤其在海马中c-jun阳性细胞密集而核深，72h c-fos基本上已无表达，而c-jun仍有较明显的阳性神经元。结论：脑挫伤后，同侧脑组织c-jun基因表达较c-fos更强烈、更广泛和表达时间更长。     

成纤维细胞生长因子9影响成骨细胞核心结合因子α1基因表达的作用

目的：探讨成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor-9，FGF-9)对成骨细胞核心结合因子α1(cbfal)的调节作用及其与有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated pmtein kinase，MAPK)信号传导通路的关系，从而为骨质疏松症等骨性疾病发病机制的研究奠定了理论基础。方法：在成功构建含小鼠Cbfal基因调控序列的荧光素酶报告基因表达质粒的基础上，利用瞬时转染技术，同时应用RT-PCR方法检测FGF-9对Cbfal基因启动子活性和mRNA表达的影响，以及MAPK信号传导通路在其中的作用。结果：MC3T3-El细胞中，FGF-9(1&;#215;10^-9～1&;#215;10～mol／L)作用24h能够降低Cbfal基因启动子活性(P&;lt;0．05)。加入PD98059(10μmol／L)后阻断了FGF-9所诱导的Cbfal基因启动子活性的降低(P&;lt;0．01)。C2C12细胞中，1&;#215;10^-5mol／L的FGF-9处理后亦可以降低小鼠Cbfal基因启动子活性(P&;lt;0．05)，且未见到PD98059的阻断作用(P&;lt;0．01)。另外，在MC3T3-E1细胞中，FGF-9(1&;#215;10^-9mol／L)处理后Cbfal基因mRNA水平于第4天开始下降，且持续至第6天：C2C12细胞中未见到FGF-9(1&;#215;10^-7mol／L)对Cbfal基因mRNA表达水平的刺激或抑制作用。结论：FGF-9部分通过MAPK信号传导通路抑制MC3T3-E1和C2C12细胞中小鼠Cbfal基因启动子活性及mRNA的表达。     

TRAF6,TAK1和TGF-β基因在弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗前后外周血单个核细胞中的表达

本研究检测弥漫大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）患者外周血单个核细胞中TRAF6、TAK1及TGF-β基因在化疗前后的表达变化,探讨化疗对TRAF6/TAK1信号通路活性的影响.采用Ct值比较法,通过SYBR Green Ⅱ实时定量PCR检测38例DLBCL患者化疗前及化疗2周期后外周血单个核细胞（PBMNC）中TRAF6、TAK1及TGF-β在mRNA的表达水平,并以12例健康人PBMNC作为对照.结果表明：DLBCL患者治疗前后PBMNC中TRAF6、TAK1和TGF-β mRNA表达水平均高于正常人.治疗前患者TRAF6及TAK1基因表达水平与正常人相比未发现统计学差异（P＞0.05）,治疗后这两基因的表达明显增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在此同时治疗后与治疗前相比,这两基因的表达水平也具明显统计学差异（P＜0.05）,且这两基因的表达水平呈明显正相关,而TGF-β基因治疗后较治疗前明显下降,差异具统计学差异（P＜0.05）.结论：DLBCL患者化疗后TRAF6/TAK1信号通路的活性明显增高,而TGF-β基因治疗后则较治疗前明显下降.     

细胞外调节蛋白激酶与核因子-κB活化对重症急性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡延迟的调控作用

目的探讨细胞外调节蛋白激酶和核因子-κB活化对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠中性粒细胞凋亡延迟的调控作用。方法60只雄性SD大鼠随机分为对照组、SAP组、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine thiocarbamate,PDTC）组（CPTC组）和细胞外调节蛋白激酶特异性抑制剂PD98059组各15只,对照组大鼠仅作开腹再缝合,SAP组、PDTC组和PD98059组大鼠采用胆胰管逆行注射质量分数4％牛磺胆酸钠建立SAP模型,PDTC组和PD98059组大鼠造模前分别注射PDTC和PD98059,对照组和SAP组仅注射等量生理盐水。24h后于大鼠下腔静脉取血分离中性粒细胞,体外培养16h后采用流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡率和Bcl—xl基因表达情况。结果体外培养16h后,SAP组中性粒细胞凋亡率明显低于对照组、PDTC组和PD98059组（P〈0．01）,Bcl—xl基因表达水平明显高于对照组、PDTc组和PD98059组（P〈0．01）;PDTC组和PD98059组中性粒细胞凋亡率低于对照组（P〈0．01）;PD98059组Bcl—xl基因表达水平高于对照组（P〈0．01）,PDTC组与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论SAP时大鼠中性粒细胞中Bcl-xl表达明显增加,导致其自发凋亡率减低,PD98059或PDTC可明显抑制Bcl-xl表达,恢复其自发凋亡率。     

PI3K/AKT信号通路在急性白血病中调控机制的初步研究

本研究探讨PI3K/AKT通路中的PTEN、CCND1、mTOR、RICTOR、FOXO1基因在急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中与正常人中表达的差异,以期查明PI3K/AKT通路在白血病中是否存在通路失调。随机收集16例骨髓标本,其中白血病12例(AML 6例,ALL 6例),正常骨髓标本4例。用实时定量RT-PCR方法检测PI3K/AKT通路中的PTEN、CCND1、mTOR、RICTOR、FOXO1基因的表达变化;以管家基因GAPDH为内参,按2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。结果表明:PTEN、mTOR、RICTOR在AML、ALL中总体呈低表达趋势,PTEN在12例标本中有10例低表达,mTOR在12例标本中9例低表达,RICTOR在12例标本中7例低表达;FOXO1,CCND1在AML、ALL中则呈高表达趋势,FOXO1在12例标本中有9例高表达,CCND1在12例标本中7例高表达。结论:PI3K/AKT信号通路基因在白血病细胞中被激活。     

MAPK途径磷酸化在胰岛素样生长因子-1促进人骨髓瘤细胞株KM3增殖中的作用

本研究探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人骨髓瘤细胞株KM3增殖的影响以及MAPK途径磷酸化在该过程中的作用。采用流式细胞术检测不同浓度的重组人IGF-1处理后KM3细胞周期的变化,Western blot法检测细胞内MAPK信号转导途径主要分子Erk1/2磷酸化在IGF-1刺激及PD98059特异性抑制作用下的改变,TUNEL法检测特异性阻断Erk1/2磷酸化在抑制KM3细胞增殖和诱导凋亡中的作用。结果表明,IGF-1可以显著提高S期和G2/M期的KM3细胞比率和细胞内Erk1/2分子的磷酸化水平,阻断IGF-1引起的Erk1/2磷酸化可以显著抑制KM3细胞的增殖并引起其凋亡。结论:IGF-1引起的Erk1/2分子磷酸化在KM3细胞增殖过程中起着十分重要的作用。     

Inhibition of extracellular signal-regulated kinase suppresses endotoxin-induced nitric oxide synthesis in mouse macrophages and in human colon epithelial cells

Macrophages produce large amounts of nitric oxide (NO) in response to proinflammatory cytokines and lipopolysaccharide (LPS) by expressing inducible isoform of NO synthase (iNOS). We examined the role of extracellular signal-regulated kinase p42/44(MAPK) (Erk1/2) in signal transduction pathways leading to induction of NO synthesis in response to LPS in J774 mouse macrophages and T-84 human colon epithelial cells. LPS activated Erk1/2 and induced iNOS and subsequent NO production. Erk1/2 activation was inhibited by PD 98059, a specific inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase (Mek) that is an upstream activator of Erk1/2. At corresponding concentrations PD 98059 reduced LPS-induced NO formation by 40 to 50% by inhibiting iNOS expression in J774 and T-84 cells. Inhibition of iNOS expression was not mediated by nuclear factor-kappaB because PD 98059 had no effect on nuclear factor-kappaB activity in J774 macrophages. In addition, PD 98059 reduced LPS-induced L-arginine transport into the cells as measured in J774 macrophages, whereas the availability of tetrahydrobiopterin was not a limiting factor in NO production after PD 98059. Our results indicate that Erk1/2 activation mediates up-regulation but is not essential for LPS-induced iNOS expression.     

PD98059对肝癌细胞Ras-MAPK信号转导的作用

目的:探讨PD98059对肝癌细胞信号转导的作用及其作用机制。方法:将PD98059加入肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,通过细胞活力、DNA合成、MAPK活性和MAPK含量的变化,观察PD98059对肝癌细胞信号转导的作用。结果:PD98059可明显抑制SMMC-7721细胞活力、DNA合成、MAPK活性和MAPK含量(与对照组比较,P<0.05),其抑制作用具有浓度依赖性。结论:PD98059可通过阻断Ras-MAPK信号通路而发挥其抑制作用;Ras-MAPK通路极有可能成为肝癌治疗的新靶点。     

抑制Ras信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化

为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem cells,ES cells）造血分化的影响,将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞,免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用,应用半定量RT-PCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：RasN17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化,携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1、SCL及beta-major珠蛋白等基因的表达被显著抑制,而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。     

丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化作用中细胞外信号调节激酶通路的改变

本研究探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路在丁酸钠（NaB）诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制.用Western blot方法检测总ERK和磷酸化ERK的表达水平;将ERK特异性的抑制剂PD98059与丁酸钠联合应用,观察它们对SKM-1细胞生长曲线的影响及分化效应,并用Western blot方法检测P21和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）蛋白质的表达水平.结果表明：SKM-1细胞经1mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK的表达水平下降;丁酸钠及丁酸钠＋PD98059均可以上调P21和HDAC蛋白质的表达水平,且丁酸钠联合PD98059的作用强于丁酸钠单用.结论：ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制.     

视黄酸诱导小鼠骨髓基质细胞c-fos，c-jun和GM-CSFmRNA表达

为了探讨维生素A(VA)对造血微环境调节的机理,采用体外培养和原位杂交技术动态检测全反式视黄酸(ATRA)诱导小鼠骨髓基质细胞(BMSC)30,60和120分钟后c-fos,c-jun及GM-CSF mRNA的表达。结果表明:①ATRA处理30分钟后c-fos和c-jun的表达即有增强,与对照组相比有显著差异(P<0.01),并持续表达至60分钟和120分钟时降至对照组水平;②GM-CSFmRNA的表达在30分钟和60分钟时与对照组水平相比无显著性差别,直至120分钟才表现出显著性差异(P<0.01)。实验结果提示:VA对造血微环境调节的机理可能是通过诱导BMSC中c-fos和c-jun mRNA的表达进而调控造血生长因子GM-CSF的分泌。