ERK1/2和P38在7-二氟甲氧基金雀异黄素抗H2O2损伤PC12细胞中的作用

[目的]探讨7-二氟甲氧基金雀异黄素(FMGEN)对神经细胞氧化应激损伤的保护作用机制.[方法]以H2O2损伤PC12细胞为神经细胞氧化应激模型,多功能生化分析仪测定培养液上清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western-Blot测定磷酸化ERK1/2蛋白和磷酸化p38蛋白的表达水平.[结果]H2O2孵育的PC12细胞培养液中LDH量明显增高,FMGEN呈浓度依赖性的降低H2O2诱导PC12细胞LDH的释放;FMGEN处理细胞后均可使ERKl/2蛋白的磷酸化水平升高,ERK1/2特异性抑制剂U0126可显著阻断FMGEN对H2O2损伤PC12细胞的拮抗作用;FMGEN抑制H2O2激活PC12细胞P38,P38特异性抑制剂SB203580可显著减轻H2O2对PC12细胞的损伤作用.[结论]FMGEN对PC12细胞氧化应激损伤的拮抗作用可能与其激活ERK1/2和抑制P38的活性有关.     

茶多酚对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的：探讨茶多酚（TP）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP^＋）诱导的帕金森病细胞模型的保护作用及机制。方法：将MPP＋或TP加入培养的PCI2细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性及代谢状态,荧光法测定细胞内活性氧（ROS）水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测bcl-2基因mRNA表达,比较各组的差异。结果：与MPP＋组相比TP＋MPP＋组细胞存活率明显升高,凋亡率、ROS水平明显降低,bcl．2mRNA表达升高。结论：TP可通过抗氧化及抗凋亡机制保护PCI2细胞免于MPP^＋的损伤     

刺五加皂甙保护PC12细胞活性与缺氧诱导因子1α的表达

目的:观察刺五加皂甙对正常培养和缺氧条件下PC12细胞的活性和缺氧诱导因子1α表达的影响,探讨刺五加皂甙抗神经元缺氧损伤的可能机制。方法:实验于2004-09/2005-05在南通大学医学院航海医学研究所进行。培养大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株,加入终浓度为0.05mg/L的神经生长因子和终浓度为125mmol/L的氯化钴分别建立神经生长因子诱导PC12细胞分化的神经元模型和氯化钴诱导缺氧的模型;四甲基偶氮唑法检测12.5,25,50,100,150mg/L的刺五加皂甙对正常培养的和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞活性的影响;蛋白免疫印迹检测刺五加皂甙对正常培养和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞中缺氧诱导因子1α表达的影响,以上实验均以神经生长因子作为阳性对照。结果:①正常培养的PC12细胞为圆形,呈簇状生长。50mg/L神经生长因子诱导3d后,细胞停止增殖,部分PC12细胞开始呈现出神经元样的形态,产生类似于神经元的突起。随着诱导时间延长神经元样的细胞逐渐增多,至第7天,PC12细胞的突起形成网络。②12.5～100mg/L的刺五加皂甙可增加正常培养PC12细胞的活性,其中50mg/L刺五加皂甙作用最强。50mg/L刺五加皂甙的预处理可降低因缺氧引起的细胞活性的下降(P<0.01),其作用与50mg/L神经生长因子相当(P>0.05)。③正常培养的PC12细胞不表达缺氧诱导因子1α,氯化钴引起的缺氧可诱导PC12细胞表达缺氧诱导因子1α,刺五加皂甙、神经生长因子也可诱导缺氧诱导因子1α表达;刺五加皂甙和神经生长因子的预处理可以进一步增强缺氧PC12细胞中缺氧诱导因子1α的表达(P<0.01),刺五加皂甙和神经生长因子的作用差异无显著性(P>0.05)。结论:50mg/L的刺五加皂甙对PC12具有明显的缺氧保护作用,其抗缺氧损伤的作用与促进缺氧诱导因子1α的表达有关。     

促红细胞生成素对MPP~+诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的:探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞模型的保护作用。方法:使用MPP+处理PC12细胞,建立多巴胺能细胞损伤模型,使用不同浓度的EPO预处理细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光酶标仪检测细胞内活性氧物质水平,比较各组间的差异。结果:MPP+处理后PC12细胞活力下降,250μmol/LMPP+处理24h后,细胞活性下降为对照组的39.64%,而EPO预处理组随着EPO浓度的增加,细胞活力逐渐上升,40U/mlEPO为促进细胞活力的最佳浓度。EPO预处理组细胞凋亡率明显低于单独MPP+组(P<0.01),且EPO预处理组的细胞内活性氧物质水平明显低于单独MPP+组(P<0.01)。结论:EPO对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,这种保护作用可能与其抗氧化应激作用有关。     

刺五加皂甙保护PC12细胞活性与缺氧诱导因子1α的表达

目的：观察刺五加皂甙对正常培养和缺氧条件下PC12细胞的活性和缺氧诱导因子1α表达的影响，探讨刺五加皂甙抗神经元缺氧损伤的可能机制。 方法：实验于2004—09／2005—05在南通大学医学院航海医学研究所进行。培养大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株，加入终浓度为0．05mg／L的神经生长因子和终浓度为12.5mmol／L的氯化钻分别建立神经生长因子诱导PC12细胞分化的神经元模型和氯化钴诱导缺氧的模型；四甲基偶氮唑法检测12．5，25，50，100，150mg／L的刺五加皂甙对正常培养的和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞活性的影响；蛋白免疫印迹检测刺五加皂甙对正常培养和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞中缺氧诱导因子1α表达的影响，以上实验均以神经生长因子作为阳性对照。 结果：①正常培养的PC12细胞为圆形，呈簇状生长。50mg／L神经生长因子诱导3d后，细胞停止增殖，部分PC12细胞开始呈现出神经元样的形态，产生类似于神经元的突起。随着诱导时间延长神经元样的细胞逐渐增多。至第7天，PC12细胞的突起形成网络。②12.5～100mg／L的刺五加皂甙可增加正常培养PC12细胞的活性，其中50mg／L刺五加皂甙作用最强。50mg／L刺五加皂甙的预处理可降低因缺氧引起的细胞活性的下降（P〈0．01），其作用与50mg／L神经生长因子相当（P〉0.05）。③正常培养的PC12细胞不表达缺氧诱导因子1α，氯化钴引起的缺氧可诱导PC12细胞表达缺氧诱导因子1α，刺五加皂甙、神经生长因子也可诱导缺氧诱导因子14表达；刺五加皂甙和神经生长因子的预处理可以进一步增强缺氧PC12细胞中缺氧诱导因子1α的表达（P〈0．01），刺五加皂甙和神经生长因子的作用差异无显著性（P〉0．05）。 结论：50mg／L的刺五加皂甙对PC12具有明显的缺氧保护作用，其抗缺氧损伤的作用与促进缺氧诱导因子1α的表达有关。     

三七皂苷对造血细胞AP-1家族转录调控蛋白NF-E2,c-jun和c-fos的诱导作用

为了进一步研究三七总皂苷(PNS)对转录调控蛋白AP-1家族的主要成员NF-E2、c-jun和c-fos转录因子的诱导作用，探讨PNS在造血细胞内的信号传递途径，选用人粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01 4个细胞株作靶细胞，经PNS刺激处理后提取细胞核蛋白，分别用人抗NF-E2、c-jun和c-fos抗体与核蛋白作Western blot杂交试验，并用^32P标记的具有与NF-E2、c-jun和c-fos转录因子共同结合位点的AP-1双链寡核苷酸探针作电泳带移动阻滞试验(EMSA)。结果表明：①western blot显示PNS诱导HL-60，K562，CHRF-288和Meg-01 4株细胞的NF-E2和c-jun转录因子蛋白水平分别是未经处理细胞的1．5-2．5倍和2．0—3．0倍。诱导的c-fos蛋白在K562，CHRF-288和Meg-01 3株细胞分别提高2．0—3．0倍，但HL-60细胞的c-fos在PNS处理后无明显变化；②EMSA显示AP-1转录调控蛋白与DNA结合复合物的特异性条带，经PNS诱导后4株细胞的AP-1蛋白与DNA复合物条带密度明显高于未经处理的细胞。结论：PNS在造血细胞内对基因的转录调控涉及到AP-1家族转录因子成员NF—E2、c—jun和c—fos，通过诱导这些转录因子量的增加，与特异性DNA促进子结合的活性增高而调控与细胞增殖分化相关的基因的表达。     

芒果苷改善过氧化氢诱导帕金森细胞模型的 氧化应激损伤

目的:观察芒果苷对过氧化氢(H_2O_2)诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型的细胞损伤的保护作用,并探讨其作用的分子机制。方法:培养SH-SY5Y细胞,分为空白对照组(PBS平行处理)、模型组(含100μmol/L的H_2O_2培养基处理细胞4 h)、芒果苷高、中、低剂量组(先用含芒果苷100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L的培养基处理4 h后,加入200μmol/L的H_2O_2培养基处理细胞4 h)。采用MTT法检测芒果苷对损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响;western-blot检测SH-SY5Y细胞中DUSP6、ERK1/2、Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平;试剂盒检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平、细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果:与空白对照组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH和MDA水平升高,SOD水平降低。与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组细胞存活率显著升高,LDH和MDA水平降低,SOD水平升高。与空白对照组相比,模型组中的DUSP6蛋白表达增加,p-ERK1/2蛋白表达减少;与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组DUSP6蛋白表达减少,p-ERK1/2蛋白表达增加。与空白对照组相比,模型组中的Nrf2和HO-1蛋白表达减少,Keap1蛋白表达增多;与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组Nrf2和HO-1蛋白表达增多,Keap1蛋白表达减少。结论:芒果苷对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有显著的保护作用,其机制可能与芒果苷调控DUSP6/ERK1/2与Keap1/Nrf2通路,改善氧化应激相关。     

脊髓缺血再灌注损伤中即早基因表达及细胞凋亡的研究

目的细胞凋亡是受一些基因控制的,很多因素可激活这些基因而导致细胞凋亡。研究脊髓缺血再灌注损伤(SCII)后即早基因(c-fos、c-jun)表达的变化和细胞凋亡。方法制作SCII动物模型,采用光镜、荧光显微镜、激光多普勒超声、免疫组化等技术,研究SCII后即早基因(c-fos、c-jun)表达的变化和细胞凋亡。结果缺血30min,血灌流量平均下降85.37%,再灌流即刻血灌流量迅速升高,再灌流10min左右达到最高点。再灌流30min,血灌流量基本恢复到缺血前的基线水平,以后逐渐降低。缺血的部分再灌注后出现“二次瘫痪”现象。荧光染色发现缺血再灌注后脊髓神经细胞有凋亡的形态学改变:如核固缩、边聚等。实验组动物脊髓神经细胞核中出现棕色c-fos和c-jun的阳性表达产物,对照组仅有轻微c-fos和c-jun表达。结论脊髓缺血一定时间后恢复血液供应,可以发生再灌注损伤。脊髓缺血再灌注后c-fos和c-jun的表达均增加,而且在SCII后细胞死亡以凋亡为主,c-fos和c-jun可能参与了I/R损伤诱导的神经细胞凋亡。     

PD98059对急性淋巴细胞白血病细胞MAPK信号通路的抑制作用

本研究检测阻断Ras／Erk信号通路对原代人类急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞重要转录因子c-fos、c-jun、弼削基因表达的影响。筛选PD98059作用的最佳有效浓度和时间,采用SYBRGreenI实时定量PCR检测PD98059作用于原代ALL细胞前后和正常人原代细胞的目的基因的表达水平。结果表明：与正常人原代细胞相比,处理前原代ALL细胞c-fos、TAK1 mRNA的相对表达升高（P值分别为0．014和0．017）。经PD98059处理后原代ALL细胞中c-fos、c-jun、TAK1 mRNA的相对表达情况为：c-los、c-jun mRNA7个样本均低表达,TAK1 mRNA5个样本低表达,2个样本高表达;较处理前c-los、c-jun、TAK1 mRNA表达明显下降（P值均为0．018）。处理后原代ALL细胞与正常人原代细胞相比,c-fos、c-jun、TAK1mRNA表达无统计学差异。结论：原代ALL细胞的c-fos和弼脚基因的活性增高,阻断ALL细胞的Ras／Erk信号通路可导致重要转录因子c-fos、c-jun、TAK1基因表达明显下降。     

雌激素对MPP+诱导的PC12细胞损伤后Bcl-2蛋白含量的影响

目的:观察雌激素在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPP )引起PC12细胞损伤的过程中对凋亡抑制蛋白Bcl-2的影响,从而阐明雌激素对帕金森病的保护作用。方法:实验于2004-03在华中科技大学同济医学院神经科实验室完成。①细胞分组:对照组;雌激素组;雌激素 MPP 组;MPP 组。②帕金森病细胞模型的建立:用250μmol/L的MPP 处理细胞,造成细胞凋亡的帕金森模型。③应用SABC法检测PC12细胞内的Bcl-2蛋白表达,反转录-聚合酶链反应检测Bcl-2基因表达产物的mRNA的水平,Westernblot检测Bcl-2蛋白的水平。结果:①雌激素组Bcl-2阳性PC12细胞平均吸光度(0.438±0.065)明显高于空白对照组(0.216±0.067),雌激素 MPP 组(0.283±0.036),MPP 组(0.112±0.034),SABC显色明显增强(P<0.05)。②雌激素组Bcl-2基因表达产物的mRNA的水平(1.30±0.19)明显高于空白对照组(0.70±0.15),雌激素 MPP 组(0.66±0.26),MPP 组(0.29±0.08)(P<0.05)。③雌激素组Bcl-2蛋白的水平(129±19)明显高于空白对照组(81±23),雌激素 MPP 组(72±12),MPP 组(48±11);雌激素 MPP 组与空白对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论:在MPP 对PC12细胞损伤的过程中,雌激素通过促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的增高,对神经细胞起保护作用。     

ERKl／2信号通路在高糖诱导的HK-2上皮间质转分化中的作用

目的：观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路活化在上皮间质转分化中的作用,从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为正常对照组、高糖组、ERK1/2通路抑制剂PD98059＋高糖组和高渗组,处理72 h后收集细胞,应用免疫细胞化学方法检测α-SMA、CK18的表达;应用Western blot法检测磷酸化ERK1/2、总ERK1/2表达水平的变化。结果（1）正常对照组胞质有大量CK18蛋白阳性表达,而α-SMA蛋白表达呈阴性;高糖组胞质中可见大量α-SMA蛋白强阳性染色,而CK18蛋白呈阴性表达;经PD98059处理后,CK18表达较高糖组染色深,而α-SMA表达较高糖组染色浅;高渗组胞质中CK18呈阳性表达,α-SMA表达呈阴性。（2）正常对照组可见少量总ERK1/2表达,p-ERK1/2蛋白仅有微量表达;经高糖刺激48 h后,总ERK1/2表达较正常对照组无明显差异,p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P＜0.05）;而使用PD98059处理后,总ERK1/2的变化不大,但p-ERK1/2蛋白的表达却显著降低（P＜0.05）;高渗组与正常对照组无显著差异。结论 ERK1/2信号通路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化过程,阻断 ERKl/2可部分抑制人近端肾小管上皮细胞的转分化,进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。     

The Ras signaling pathway mediates cetuximab resistance in nasopharyngeal carcinoma

This work aimed to investigate the role of the Ras signaling pathway in cetuximab resistance in human nasopharyngeal carcinoma (hNPC). An hNPC 5-8F cell line was induced by stepwise exposure to increasing doses of cetuximab. Western blot was conducted to detect protein levels. Our results are as follows: cetuximab-resistant hNPC 5-8F/Erbitux cell lines were successfully developed. After treatment with cetuximab for 3 and 5 d, the RI was 1.2 and 1.1, respectively. Compared with the 5-8F cells, the protein expression levels of H-ras, JNK/P-JNK, P-ERK1/2, p38/P-p38, P-AKT, NF-κB p65/P-NF-κB p65 and c-fos were significantly increased in the 5-8F/Erbitux cells (P = 0.000 for all); however, the protein expression levels of ERK1/2 and c-jun/P-c-jun were significantly decreased (P = 0.000 for all) and AKT protein expression showed no significant change (P = 0.176). After the 5-8F/Erbitux cells were transfected with H-ras shRNA, H-ras protein expression was significantly decreased (P = 0.000) and cetuximab sensitivity improved. In contrast, in the 5-8F/Erbitux + siH-ras cells, protein expression levels of P-ERK1/2, P-JNK, P-AKT and NF-κB p65/P-NF-κB p65 were significantly decreased (P = 0.000 for all). Additionally, protein expression levels of JNK, ERK1/2, p38/P-p38 and c-jun/P-c-jun were significantly increased (P = 0.000 for all), but protein expression levels of AKT and c-fos did not change significantly (P = 0.061 and P = 0.068, respectively). In conclusion, the activation of the H-ras/ERK1/2, H-ras/JNK and PI3K-AKT signaling pathways is closely associated with cetuximab resistance in 5-8F/Erbitux cells. NF-κB is activated in 5-8F/Erbitux cells without activation of c-jun.     

视黄酸诱导小鼠骨髓基质细胞c-fos，c-jun和GM-CSFmRNA表达

为了探讨维生素A(VA)对造血微环境调节的机理,采用体外培养和原位杂交技术动态检测全反式视黄酸(ATRA)诱导小鼠骨髓基质细胞(BMSC)30,60和120分钟后c-fos,c-jun及GM-CSF mRNA的表达。结果表明:①ATRA处理30分钟后c-fos和c-jun的表达即有增强,与对照组相比有显著差异(P<0.01),并持续表达至60分钟和120分钟时降至对照组水平;②GM-CSFmRNA的表达在30分钟和60分钟时与对照组水平相比无显著性差别,直至120分钟才表现出显著性差异(P<0.01)。实验结果提示:VA对造血微环境调节的机理可能是通过诱导BMSC中c-fos和c-jun mRNA的表达进而调控造血生长因子GM-CSF的分泌。     

坎地沙坦干预海仁藻酸致痫大鼠肾脏细胞外信号调节激酶的表达及其机制

目的 探讨坎地沙坦干预后海仁藻酸(kainic acid,KA)致痫大鼠肾脏细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的表达及其变化的机制.方法 105只雄性Wistar大鼠随机分为3组:A1-5对照组、B1-5致痫组、C1-5坎地沙坦组,每组各35只,1-5分别表示癫痫后0、2、6、12及24 h.采用立体定位仪下杏仁核内注...     

人参二醇对鱼藤酮MPP＋诱导的BV2细胞活性下降的作用

目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP＋诱导的小鼠小胶质细胞活性下降的影响。方法以小鼠BV2细胞为研究对象,以鱼藤酮（0．03、0．1、0．3、1、3μmol／L）或MPP＋（10、30、100、300、1000μmol／L）处理24h和诱导细胞活性下降。设阴性对照组、人参二醇对照组（100mg／L）,鱼藤酮（0．1μmol／L）或MPP＋（100μmol／L）损伤组,人参二醇治疗组（10、25、50、75、100mg／L）。采用MTT法检测细胞活性。结果各浓度人参二醇对BV2细胞的活性无明显影响。鱼藤酮或MPP＋处理24h可诱导BV2细胞活性下降,各浓度人参二醇不能逆转鱼藤酮或MPP＋造成的细胞活性下降。结论人参二醇对鱼藤酮或MPP＋诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。     

染料木黄酮对小鼠子宫内膜癌c-fos、cj-un mRNA表达的影响

目的探讨染料木黄酮对雌二醇-17β(E2)所诱发的小鼠子宫内膜癌c-fos、c-jun mRNA表达的影响。方法利用免疫组化方法和定量RT-PCR法检测小鼠子宫内膜癌细胞c-fos、c-jun mRNA的表达量。结果E2单独投与群c-fos、c-jun mR-NA表达增强,与E2单独投与群比较,E2和染料木黄酮联合投与群明显抑制E2刺激所诱发的c-jun表达增强。c-fos mRNA表达有减少趋势。结论E2皮下注射的雌性ICR小鼠给予染料木黄酮后c-fos、c-jun mRNA表达减少,对子宫内膜癌的预防有一定的意义。     

长期应激对大鼠学习与记忆及纹状体边缘区c-Fos、c-Jun表达的影响

目的：探讨长期应激对大鼠学习、记忆及及纹状体边缘区即刻早期基因表达的影响.方法：将40只成年雄性SD大鼠分为两组：每组20只.应激组和对照组, 应激组大鼠持续暴露于应激原环境中达3周,用Morris水迷宫和Y 迷宫作业测试其空间学习与记忆成绩, 再应用免疫细胞化学方法检测c-Fos、c-Jun蛋白在纹状体边缘区内的表达.结果：（1）Morris水迷宫测试：应激组大鼠应激后寻找平台的潜伏期较对照组明显延长（P＜0.05）,Y迷宫测试：应激组大鼠寻找安全区的正确率明显低于对照组（P＜0.01）;（2）应激组纹状体边缘区c-Fos、c-Jun蛋白表达水平较对照组明显下调（P＜0.05）.结论：长期应激可减弱学习与记忆能力, 纹状体边缘区即刻早期基因表达变化可能是应激影响学习与记忆的机制之一.