结核分枝杆菌DNA疫苗的研究进展

结核病是全球范围内一种严重的细菌感染性疾病，其病原菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)。目前，全世界有近三分之一人口感染Mtb，每年约有9百万新发临床结核病例及2～3百万死亡病例，同一时间约有6千万病例处于活动感染期^[1]。如此严重的感染发病情况对人类健康和社会经济等诸多方面都造成了巨大的损失。     

结核病遗传学研究进展及新方向

美国国立心肺血液研究所（NHLBI）于2005年9月发布了一篇有关结核病基础研究方向的报告。全世界平均每年190万人死于结核分枝杆菌（Mtb）感染，每年新感染约880万例，1／3的世界人口感染了Mtb。为合理地开发新的诊断和防治策略，了解Mtb和宿主的关系尤为重要。     

结核病DNA疫苗研究进展

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的以呼吸道为主的一种传染性疾病,严重危害人类健康。随着医学科学技术的发展,人类对抗TB已取得了一定的成果,包括有效的治疗药物及疫苗的研发。但同时由于Mtb耐药的严重性、人类免疫缺陷性病毒( HIV)与Mtb的双重感染及流动人口的日益增多、吸毒等,加上不少国家对TB的忽视,TB在全球范围内呈回升趋势。世界卫生组织发布的《2012年全球结核病控制报告》[1]指出,虽然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趋势,但每年仍有数百万TB新发病例,2011年全球新增TB患者870万人,死于TB的人数为140万人,其中新增TB患者中有3.7%患有耐多药TB,全球TB负担仍然十分严重。     

结核分枝杆菌毒力基因的筛选策略

结核病已被WHO列为世界三大传染病之一，其病原菌结核分枝杆菌（Mtb）的致病机制仍不十分清楚。由于多耐药Mtb日渐增多，研发新型抗结核药物及疫苗已势在必行，Mtb毒力基因的研究将因此而成为关键热点。近年来建立的结核分枝杆菌毒力基因的筛选策略主要有差异显示PCR法（DDRT-PCR）、消减杂交法（SH）、体内互补技术及标签转座子诱变技术（STM）等，通过这些方法已发现了rpoV、KatG、erp等诸多Mtb毒力基因。这些技术各有利弊，对于它们各自特点的把握及作出相应的改进，将在今后Mtb及其它病原生物毒力基因的研究中发挥重要作用。     

GeneXpert Mtb/RIF检测技术在结核病诊断中的应用探讨

目的分析Gene Xpert Mtb/RIF检测技术快速诊断肺结核及利福平耐药的可靠性。方法对2014年7月~2015年12月某院门诊纳入的92例肺结核可疑患者送检的痰标本进行涂片镜检,同时开展固体培养和Gene Xpert Mtb/RIF检测。对比3种检测方法的符合性和一致性。结果对92份涂片检测标本涂片和培养,Gene Xpert Mtb/RIF检测结果敏感度、特异度分别为88.24%、69.33%和78.95%、85.18%。与临床诊断比较,Gene Xpert Mtb/RIF检测结核病敏感度、特异度分别为48.05%、93.33%。在进行传统利福平药敏试验的31份标本中,Gene Xpert Mtb/RIF检测结核病利福平耐药敏感度、特异度分别为100.00%、96.55%。结论 Gene Xpert Mtb/RIF法能够快速初步检出结核分枝杆菌,对发现结核病患者和耐药结核病患者具有重要价值。     

GeneXpert Mtb/RIF检测技术在临床耐药结核病诊断中的应用价值

目的 评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术在临床耐药结核病诊断中的应用效果。方法 收取240例结核病住院患者的晨痰样本分别进行痰涂片镜检、MGIT960液体培养及GeneXpert Mtb/RIF快速检测,对于MGIT960液体培养与GeneXpert同为阳性的样本进一步进行MGIT960药敏检测。以MGIT960液体法作为金标准,评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术的敏感性和特异性以及Kappa值。结果 224例有效样本中涂片镜检阳性检测率为26.8%,MGIT960液体培养阳性检出率为45.1%,GeneXpert检测阳性检出率为46.9%;以MGIT960液体培养作为金标准,涂片镜检法的敏感度为59.4%,特异度为75.0%,GeneXpert检测法敏感度为91.1%,特异度为92.4%;以MGIT960药敏检测为金标准,GeneXpert检测法与之相比两种方法的一致性为96.7%,敏感度为92.3%,特异度为98.5%。结论 GeneXpert Mtb/RIF检测技术是一个敏感、特异和快速有效方法,有利于结核病的早期诊断。     

广州地区Mtb/HIV双重感染筛查情况及临床疗效

目的探讨广州市结核病控制项目结核病/艾滋病(Mtb/HIV)双重感染筛查转介防治效果。方法收集分析广州市6个区(荔湾区、越秀区、海珠区、天河区、白云区、番禺区)2013-2014年登记的13 697例结核病患者和可随访到的9 093例人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或获得性免疫缺陷综合症(AIDS)患者双向筛查情况,以及筛查出的肺结核与艾滋病双重感染患者治疗转归情况。结果 2013-2014年登记的结核病患者接受HIV抗体检测率为18.77%(2 571/13 926),HIV阳性检出率为0.19%(5/2 571)。可随访到的艾滋病患者经肺结核筛查,结核病患者检出率为1.87%(170/9 093)。艾滋病患者和结核病患者在Mtb/HIV双筛检出率上差异有统计学意义(χ~2=38.055,P0.01)。双筛出的结核病与HIV双重感染患者抗痨治疗初治涂阳肺结核治愈率为69.23%,复治涂阳肺结核治愈率为42.86%,总体治疗成功率为72.05%,总体病死率为8.70%。结论 Mtb与HIV感染双向筛查是发现Mtb与HIV双重感染患者的主要途径,应加强结防机构与艾防机构合作机制,提高Mtb/HIV双重感染患者治疗成功率。     

icl mRNA特异性10-23DRz在小鼠体内抗结核分枝杆菌感染的实验研究

目的探讨iclmRNA特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在小鼠体内感染的影响,及其单独或与异烟肼(isoniazidum,INH)联合应用治疗小鼠结核病的效果。方法分别用DZ4、INH、INH+DZ4-S或INH+DZ4对Mtb进行预处理,再用上述经过预处理的Mtb感染BALB/c小鼠,一定时间后进行小鼠肺组织Mtb培养及病理学改变观察。利用DZ4-FITC溶液对BALB/c小鼠进行滴鼻处理,检测滴鼻途径给药的效果。采用尾静脉注射法建立小鼠结核病模型,将模型小鼠随机分为5组(n=10),分别给予生理盐水、DZ4、INH、INH+DZ4、INH+DZ4-polyG治疗,于治疗完成2周后进行小鼠肺组织Mtb荷菌量检测和病理学改变观察。结果Mtb感染后2周,各组小鼠的肺组织荷菌量均无显著性差异(P>0.05)。感染进行至4～12周时,INH+DZ4预处理组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量较其它各组均显著偏低(P<0.05),肺组织的病理改变较其他各组也明显轻微。经滴鼻途径给予DZ4-FITC溶液4h后,小鼠肺组织冰...     

结核感染T细胞斑点试验在活动性结核病中的辅助诊断价值

结核病是全球关注的公共卫生和社会问题,也是我国重点控制的主要疾病之一。据WHO估计,全球约有1/3人口受到结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染,全世界每年都有新发结核病例830万以及死亡病例180万[1]。我国结核病的发病率位于世界第二,每年新增结核病患者约150万,受感染人数约5亿。在结核病防治中,早期快速诊断与治疗是控制结核病的关键。目前临床应用最多的仍是痰抗酸杆菌涂片和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)皮试,前者阳性率低,后者由于与卡     

385例肺结核患者实验室检测结果比较分析

目的 探讨结核病几种实验室检测结果间的差异.方法 回顾性分析2018年10月至2019年9月本院收治的385例肺结核患者的临床资料,收集患者的Xpert MTB/RIF检测、抗酸染色、痰培养和药敏试验结果,分析Xpert MTB/RIF检测的敏感性和特异性.结果 385例肺结核患者中,Xpert Mtb/RIF检测阳性患者340例(88.3％),对结核分枝杆菌(MTB)的检出率显著高于抗酸染色法(P<0.05);以痰培养结果为金标准,Xpert MTB/RIF检测MTB和MTB耐药性的敏感度分别为86.7％和93.5％,特异度分别为0.19％和90.4％,经Kappa检验,Xpert Mtb/RIF检测与传统耐药检测具有较好的一致性.结论 Xpert Mtb/RIF检测相比其他几种方法在诊断肺结核及利福平耐药方面更简便、快捷、准确,可用于肺结核患者及利福平耐药患者的筛选,值得临床推广应用.     

GeneXpert Mtb/RIF检测技术在结核病诊断中的应用评价

目的 评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术对肺结核诊断和耐利福平肺结核筛查的效果,为筛选最佳实验室检测方法提供依据。方法 收集三亚市定点医院结核病门诊2015年5月—2016年12月243例临床诊断为肺结核的痰标本,分别进行涂片镜检、痰培养和GeneXpert Mtb/RIF检测,分析三种方法的敏感度和特异度。以比例法药敏为标准,分析GeneXpert检测利福平耐药的敏感度和特异度。结果 涂片镜检与GeneXpertMtb/RIF对比,GeneXpertMtb/RIF检测结核菌的敏感度为93.7%,特异度为28.9%,GeneXpertMtb/RIF检测与涂片镜检一致率为83.5%。痰培养与GeneXpertMtb/RIF对比,GeneXpert检测结核菌的敏感度为96.7%,特异度为56.6%,GeneXpert检测与痰培养的一致率为91.8%。利福平耐药大多与rpoB基因突变有关,GeneXpertMtb/RIF检测利福平耐药与比例法药敏一致率为98.1%, 敏感度为88.9%,特异度为98.9%,并且可检测出利福平耐药基因位点。结论 GeneXpert Mtb/RIF 检测技术适用于结核分枝杆菌及耐药结核分枝杆菌的快速筛查,在痰涂片和痰培养上补充GeneXpertMtb/RIF检测可提高病原学检出率,尽早发现耐多药病患。     

痰液分离结核分枝杆菌202株耐药性分析

目的:了解结核分枝杆菌对几种常用抗结核药的耐药性.方法:采用绝对浓度法,将每种药品配制高低2种浓度,加至改良罗氏培养基中,再接种临床分离的结核杆菌菌株,观察细菌的生长情况.结果:202株临床分离结核分枝杆菌对异烟肼、链霉素硫酸盐、乙胺丁醇、利福平、对氨基水杨酸的耐药率分别为25.7%、22.3%、5.9%、32.2%、11.4%;全部耐药菌株约占3.5%.结论:乙胺丁醇可作为结核病治疗的有效药物之一,结核分枝杆菌对几种抗结核药的耐药率有不同程度的提高,临床工作中,应增加药敏试验药物品种.     

Activities of Biapenem against Mycobacterium tuberculosis in Macrophages and Mice

Objective To assess the activities of biapenem against multidrug-resistant and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Methods Biapenem/clavulanate(BP/CL) was evaluated for in vitro activity against Mycobacterium tuberculosis(Mtb) multidrug-resistant(MDR) isolates, extensively drug-resistant(XDR) isolates, and the H37 RV strain. BP/CL activity against the H37 Rv strain was assessed in liquid cultures, in macrophages, and in mice. Results BP/CL exhibited activity against MDR and XDR Mtb isolates in liquid cultures. BP/CL treatment significantly reduced the number of colony forming units(CFU) of Mtb within macrophages compared with control untreated infected macrophages. Notably, BP/CL synergized in pairwise combinations with protionamide, aminosalicylate, and capreomycin to achieve a fractional inhibitory concentration for each pairing of 0.375 in vitro. In a mouse tuberculosis infection model, the efficacy of a cocktail of levofloxacin + pyrazinamide + protionamide + aminosalicylate against Mtb increased when the cocktail was combined with BP/CL, achieving efficacy similar to that of the positive control treatment(isoniazid + rifampin + pyrazinamide) after 2 months of treatment. Conclusion BP/CL may provide a new option to clinically treat MDR tuberculosis.     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的克隆、表达及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌Mtb81抗原基因进行克隆、表达及纯化,并评价其抗原性。方法应用聚合酶链反应技术扩增结核分枝杆菌H37Rv Mtb81 DNA序列;将目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;经SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原Mtb81基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:35.8%、98.3%和56.7%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

Evaluation of Multidrug Resistant Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detecting the Drug Resistance of Mycobacterium tuberculosis

Objective To evaluate multidrug resistant loop-mediated isothermal amplification (MDR-LAMP) assay for the early diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis and to compare the mutation patterns associated with the rpoB, katG, and inhA genes at the Chinese Center for Disease Control and Prevention.Methods MDR-LAMP assay was evaluated using 100 Mycobacterium tuberculosis (Mtb) isolates obtained from the National Reference Laboratory for Tuberculosis in China. Phenotypic resistance to isoniazid and rifampicin and whole-genome sequencing served as reference standards. Results The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) of MDR-LAMP were 85.5％, 93.6％, 96.7％, and 74.4％ for the detection of resistance to isoniazid and rifampicin, respectively, and 80.5％, 92.3％, 98.6％, and 41.4％ for the detection of Mtb cultured from smear-positive sputum samples, respectively. When DNA sequencing was used as the reference standard, the sensitivity, specificity, PPV, and NPV of MDR-LAMP were 93.1％, 92.3％, 97.2％, and 82.8％for the detection of katG and inhA gene mutations, respectively, and 89.1％, 88.9％, 93.4％, and 81.1％for the detection of rpoB gene mutation, respectively.Conclusion MDR-LAMP is a rapid and accessible assay for the laboratory identification of rifampicin and isoniazid resistance of Mtb isolates.     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌耐药基因突变位点对异烟肼体外最小抑菌浓度的影响

目的 探讨结核分枝杆菌(Mtb)耐药基因突变位点对异烟肼(INH)体外最小抑菌浓度(MIC)的影响.方法 利用基因芯片法筛选耐INH人型Mtb菌株,得到inhA-15(C-T)突变株20株、KatG315(G-C)突变株46株,另筛出非突变株32株.采用罗氏培养法对菌株进行复苏,并进行梯度浓度INH敏感性试验,了解INH对不同菌株的MIC.结果 INH对inhA-15(C-T)突变菌株的MIC为(0.375±0.079)μg/ml,对KatG315(G-C)突变菌株的MIC为(5.757±4.060)μg/ml,对无突变菌株的MIC为(0.061±0.050)μg/ml,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05).3株无突变菌株表现为低度耐药,inhA-15(C-T)突变组中有1株表现为敏感,其余表现为耐药,KatG315(G-C)突变菌株均表现为耐药.结论 基因芯片筛选的MtbinhA-15(C-T)和KatG315(G-C)突变株均对INH存在不同程度的耐药,临床可根据不同突变位点菌株的耐药结果初步判断Mtb对INH的耐药性.     

外泌体miRNA在结核病诊断和预后中的作用

结核病(tuberculosis, TB）作为一种严重的传染病,目前对结核病的预防和治疗仍未取得重大突破,诊断也不够理想。由于结核病的早期发现对于控制和预防感染传播极其重要,并且由于目前结核病诊断的挑战,开发新型生物标志物至关重要。外泌体miRNA是长度为18~22个核苷酸的小非编码RNA,在调节基因表达、翻译和细胞间传递信息中起重要作用。它们作为一种有前途的研究工具,为结核病的诊断和治疗提供了新的视角,近年来研究发现,外泌体与结核病的发生发展有密切的联系。结核病患者的血清外泌体中的miRNA代谢水平失调,可能将这些外体失调的miRNA用作新型生物标志物,用于结核病治疗监测以及活动性疾病的诊断。外泌体miRNA在结核病方面的研究已成为当前的热点之一,被认为是最有前途的候选生物标志物。本文就外泌体miRNA在结核病诊断和预后中的作用研究进展进行综述。     

原位聚合酶链反应检测结核分枝杆菌L型的初步研究

目的：建立一种不需提取ＤＮＡ的检测分枝结核杆菌Ｌ型的分子生物学方法。方法：采用原位聚合酶链反应（原位ＰＣＲ）技术,扩增结核杆菌Ｌ型及其感染的人和小鼠血标本中的结核杆菌ＩＳ６１１０基因,再用免疫组化技术显色。结果：结核杆菌Ｌ型菌株中的ＤＮＡ被扩增,血标本中,可见到红细胞和淋巴细胞周围粘附大量结核杆菌ＤＮＡ阳性颗粒。结论;红细胞和淋巴细胞具有免疫粘附功能,原位ＰＣＲ快速、简便,可用于检测稳定和不稳定分