生脉成骨胶囊在激素性股骨头坏死防治中的应用研究

目的:通过研究生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的股骨和髂骨骨髓间充质细胞增殖及矿化结节生成作用,及骨髓间充质细胞的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的变化,探讨其对机体髂、股骨间充质细胞成骨能力的影响,了解生脉成骨胶囊在防治激素性股骨头坏死方面的作用机理.方法:将40只SD雄性大鼠随机分为4组:空白对照组、模型组、生脉成骨预防用药组、生脉成骨治疗组,通过测定ALP、BGP、充质细胞的增殖能力、矿化结节数,推断股骨和髂骨近端成骨能力变化规律.结果:空白对照组、生脉成骨预防用药组、生脉成骨治疗组股骨髂骨的ALP、BGP含量均显著高于模型组(P＜0.05);各组股骨、髂骨间充质干细胞向成骨细胞转化增殖的吸光度值(OD570)和矿化结节数明显高于模型组;生脉成骨预防用药组股骨和髂骨矿化结节数、ALP高于生脉成骨治疗组.结论:生脉成骨胶囊可以促进激素性股骨头坏死大鼠模型的股骨、髂骨间充质细胞碱性磷酸酶和骨钙素合成及骨髓间充质细胞向成骨细胞转化的细胞增殖及矿化结节形成.认为生脉成骨胶囊防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机理与促进成骨细胞的分化成熟程度以及提高成骨细胞骨蛋白的分泌速度有关.     

右归饮含药血清对人骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的影响

目的：观察右归饮对体外人骨髓分化成骨细胞的影响。方法：将右归饮含药血清加入人骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞的培养体系，采用细胞形态学观察、MTT法及细胞内ALP含量检测反映其促进成骨的功能。结果：形态学观察及椰法表明，右归饮对成骨细胞的增殖起促进作用，钙结节染色及细胞内ALP含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用（P〈0．05）。结论：右归饮对人骨髓基质干细胞诱导分化的成骨细胞的成骨起促进作用。     

健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞定向分化的影响

目的:观察健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)定向分化的影响,揭示本方临床应用防治激素性股骨头坏死的药理机制。方法:以健脾补肾方含药血清作用于体外培养的rMSCs,通过对碱性磷酸酶(ALP)活性的的动态检测结果和四环素荧光标记的矿化结节的出现数量作为分析各组诱导液能否诱导rMSCs分化为成骨细胞以及促进骨向分化强度的指标。结果:rMSCs培养的第12天,健脾补肾组ALP活性高于空白对照组(P0.05);从第8天之后,健脾补肾加成骨组ALP活性高于成骨组(P0.05);更换相应培养液22d后,其余3组形成的钙结节数量明显多于空白对照组(P0.01);健脾补肾加成骨组钙结节数量多于成骨组(P0.05)。结论:健脾补肾方含药血清可以促进rMSCs的骨向分化,且与经典的成骨诱导剂合用具有协同作用。这可能揭示了临床应用该方防治激素性股骨头坏死(SINFH)的细胞学机制。     

生脉成骨胶囊对激素性股骨头坏死髋周骨髓基质干细胞ALP和BGP的影响

目的：通过研究生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的股骨和髂骨的间充质细胞的碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（BGP）的变化,探讨其对髂、股骨骨髓干细胞成骨能力的影响。方法：将60只SD雄性大鼠随机分为6组：空白对照组、模型组、生脉成骨预防用药组、阿仑磷酸钠治疗组、丹郁骨康治疗组、生脉成骨治疗纽,除空白对照纽外,其余大鼠腹腔注射醋酸泼尼松龙,建立激素性股骨头坏死动物模型。造模成功后,各组给予相应的药物或生理盐水进行灌胃。取其股骨及髂骨,收集骨髓细胞悬液进行成骨细胞诱导培养,分别用ELISA法测定ALP、BGP的含量。结果：空白对照组、生脉成骨预防用药组、阿仑磷酸钠治疗组、丹郁骨康治疗组、生脉成骨治疗组股骨髂骨的ALP、BGP,含量均显著高于模型组（P〈0．05）,丹郁骨康治疗组的股骨和髂骨,以及生脉成骨治疗组的股骨ALP含量显著高于阿仑磷酸钠治疗组（P〈0．05）。结论：生脉成骨胶囊可以促进激素性股骨头坏死大鼠模型的股骨、髂骨间充质细胞碱性磷酸酶和骨钙素合成,在促进成骨细胞分化成熟方面上显著高于阿仑磷酸钠片。初步认为生脉成骨胶囊治疗激素性股骨头缺血性坏死的作用机理与促进成骨细胞的分化成熟程度以及提高成骨细胞骨蛋白的分泌速度有关。     

复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响

目的研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响。方法采用全骨髓差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞;取P3代细胞,分实验组和对照组,用流式细胞仪测定细胞表面标志物鉴定细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线。显微镜下观察两组的细胞形态和组织化学染色的钙化结节;速率法测定碱性磷酸酶(ALP)活性和RT-PCR检测骨髓间充质干细胞诱导分化过程中骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达来鉴定成骨作用。结果体外培养的细胞表达表面标志;复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞内ALP活性增高并形成明显钙结节;PCR结果显示复叶耳蕨总黄酮上调骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达。结论 20μg/mL复叶耳蕨总黄酮可促进大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为成骨样细胞。     

仙花活骨丹颗粒对小鼠MSCs激素诱导分化的影响

目的:通过仙花活骨丹颗粒对BALB/C小鼠骨髓间充质干细胞(简称MSCs)激素诱导分化影响的观察,揭示该药物治疗大量激素导致的股骨头缺血性坏死的药理学机制。方法:采用骨髓间充质干细胞体外培养技术,以不同剂量地塞米松作为诱导剂诱导MSCs脂肪分化。用以效应剂量的药物灌胃,采用药后1h、3h、5h血清,与激素诱导的MSCs共培养21日,光镜下脂肪细胞苏丹Ⅲ染色后计数。结果:其中不含药血清各组中脂肪细胞数量最多,不同地塞米松剂量中,1×10-6mol/L组脂肪细胞数量最多。含药血清各组中1h组脂肪细胞数量最少,其次为3h和5h组。检测各组中共培养MSCs细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,含药血清组均有不同程度提高。结论:仙花活骨丹颗粒可有效抑制地塞米松诱导的MSCs脂肪分化进程,提高其成骨细胞分化能力,从而建立了该药治疗股骨头缺血性坏死的药理学机制。     

补肾活血方对大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的观察中药补肾活血方对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。方法取新生的SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞：应用MTT法,对硝基苯磷酸盐法（PNPP）及茜素红染色方法观察不同浓度补肾活血方对体外培养成骨细胞在24、48、72h不同时段的增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及矿化结节形成的影响。结果不同浓度的补肾活血方均可促进成骨细胞增殖率提高,以中、高浓度组的作用较为明显（P〈0．01）;不同浓度补肾活血方可使ALP活性增强（P〈0．01）;中、高浓度组补肾活血方矿化结节数量,显著多于对照组（P〈0．01）。结论补肾活血方具有促进成骨细胞的增殖、分化及矿化的作用。     

槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的:通过观察槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响,探讨其调控骨髓间充质干细胞及其防治骨质疏松症的作用机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,并通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物及分化能力鉴定所取得的细胞;运用MTT法检测不同浓度槲皮素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,以确定其最佳促增殖剂量。实验分为空白组、槲皮素组、经典诱导组(地塞米松+β-甘油磷酸钠+维生素C),检测诱导分化过程中ALP活性和钙化结节数目,RT-PCR的方法检测BMP-2 mRNA的变化。结果:经MTT法检测,浓度为5μmol/L和10μmol/L的槲皮素组OD值较空白组明显升高;与空白组相比,槲皮素组与经典诱导组ALP活性及矿化结节均显著增加,并均可上调MSCs骨向分化过程中BMP-2 mRNA的表达。结论:槲皮素能促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化,可能是其促进骨折愈合、防治骨质疏松症的细胞学机制之一。     

骨碎补总黄酮对经诱导的兔骨髓间充质干细胞增殖和钙沉积的影响

目的:观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和骨向分化的影响。方法:用密度梯度离心法分离兔MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨碎补总黄酮诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:骨碎补总黄酮能够诱导兔MSCs向成骨细胞分化。     

失重下骨碎补总黄酮经MAPK通路促间充质干细胞向成骨细胞分化研究

目的:观察模拟失重状态下,骨碎补总黄酮促间充质干细胞向成骨细胞分化,MAPK/ERK通路变化。方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立失重模型,加入骨碎补血清培养液,观察间充质干细胞向成骨细胞分化过程中形态学变化,MTT法测定细胞活性,PNPP法测定ALP活性,RT-PCR测定MAPK/ERK通路。结果:与空白对照组和低剂量组相比,中、高剂量组细胞增殖能力及ALP活性值均明显升高,且具有统计学意义(P0.05),与阳性对照组接近。加入TFDF后,ERK1/2通路表达明显升高(P0.05)。结论:失重下骨碎补能激活MAPK/ERK通路促间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化成熟。     

鹿瓜多肽注射液对大鼠成骨细胞增殖及分化的影响

目的:研究鹿瓜多肽注射液对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法:体外分离、培养SD大鼠成骨细胞,CCK-8法检测成骨细胞增殖活性;碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测成骨细胞ALP活性比;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨细胞Ⅰ型胶原(Col1α1)、骨钙素(Bglap)及Runx-2的表达水平。结果:鹿瓜多肽注射液干预成骨细胞3d,发现鹿瓜多肽注射液组成骨细胞活性较对照组明显增强(P<0.05);在鹿瓜多肽注射液干预细胞后第8天时,鹿瓜多肽注射液组成骨细胞ALP活性较对照组明显增加(P<0.05);鹿瓜多肽注射液组成骨细胞骨钙素及Runx-2表达均较对照组明显增强。结论:鹿瓜多肽注射液能显著促进成骨细胞发育成熟。     

羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响

目的探讨羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(Marrow Stroma Cells,MSCs)的影响。方法用MTT法检测MSCs的增殖;PNPP偶氮法检测MSCs碱性磷酸酶(ALP)的活性;细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%,1.25%,2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用(P<0.01);在含羊胎素原液的2.5%及5% 成骨诱导剂时,ALP的活性明显高于诱导剂对照组(P<0.05),而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组,ALP的活性明显高于空白对照组及诱导剂对照组(P<0.001);细胞ALP染色呈强阳性,加药组颜色明显深于对照组和诱导剂对照组。结论羊胎素对体外培养的SD大鼠MSCs的增殖和向成骨细胞分化具有明显的促进作用。     

骨康方对大鼠MSCs体外向成骨细胞分化和ALP的影响

目的:观察骨康方对大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)体外增殖并向成骨细胞分化和其对碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。方法:用流式细胞仪鉴定第3代MSCs表面抗原,采用不同浓度的含骨康方药血清联合诱导剂对大鼠MSCs定向诱导分化,观察MSCs诱导前后形态学变化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线,检测ALP活性。结果:CD34表达为阴性,CD44表达为阳性。原代MSCs及诱导后形态正常。细胞生长曲线示各组MSCs数量均随时间延长增加,联合使用高、中浓度骨康方药加诱导剂可显著提高MSCs增殖,并向成骨细胞增殖。联合使用高、中、低不同浓度骨康方药加诱导剂均可显著提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性。结论:骨康方能促进大鼠体外MSCs增殖,并向成骨细胞分化。且能提高成骨细胞的ALP活性,从而增强其成骨能力。     

红芪中5种黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成骨分化的影响

目的研究红芪中毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素5种黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)和颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)成骨性分化的影响。方法贴壁分离法培养rBMSCs;酶消解法分离培养ROBs;MTT法检测rBMSCs和ROBs细胞的增殖情况;试剂盒检测rBMSCs和ROBs的碱性磷酸酶(ALP)活性和Ca~(2+)含量;茜素红染色法检测矿化结节形成。结果 5种成分均能不同程度促进rBMSCs和ROBs的增殖,提高ALP活性,增加Ca~(2+)含量,增加钙化结节面积和数量(P0.05)。其中毛蕊异黄酮促进rBMSCs的成骨分化作用最佳,美迪紫檀素促进ROBs的成骨分化作用最佳,毛蕊异黄酮次之。结论这5种黄酮类成分对rBMSCs和ROBs的成骨功能均有一定程度地改善作用,而毛蕊异黄酮对2种细胞表现的成骨活性均较佳,可发展作为良好的骨诱导活性因子。     

骨组织工程经多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集材料的细胞毒性研究

目的：评价多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集材料的细胞毒性，为该材料应用于临床提供实验依据。方法：参照GB／T16886．5—2003-ISO 10993—5：1999标准，将不同浓度的材料浸提液分别与人间充质干细胞（Mscs），成骨细胞（OS）体外复合培养。倒置相差显微镜行细胞形态学观察；MTT比色法测定1、3、5、7d的MSCs增殖活性；金氏比色法检测OS碱性磷酸酶活性。结果：不同时间点、不同浓度材料浸提液培养的MSCs均良好增殖，毒性0～1级；5d后浸提液培养组细胞增殖率优于阴性对照组（P〈0．05），随材料浸提液浓度增加而增加；浸提液培养组OS碱性磷酸酶活性与阴性对照组相比差异无显著性（P〉0．05）。结论：经多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集支架材料无细胞毒性，实验浓度范围内利于MSCs增殖，不影响OS的成骨活性。     

红芪多糖对骨髓间充质干细胞和成骨细胞的影响

目的研究3种新型红芪多糖(HPS-1、HPS-2、HPS-3)对大鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs和颅骨成骨细胞ROBs成骨性分化的影响。方法采用MTT法检测rBMSCs细胞和ROBs细胞增殖;采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测rBMSCs细胞和ROBs细胞的ALP活性;采用茜素红染法检测rBMSCs和ROBs细胞矿化结节的形成情况。结果HPS-1(20、50μg/mL)作用48 h显著促进rBMSCs细胞增殖(P<0.05、0.01),HPS-1(20μg/mL)作用48 h显著促进ROBs细胞增殖(P<0.01);HPS-2和HPS-3对2种细胞的增殖无促进作用。HPS-1(50、100μg/mL)显著升高rBMSCs细胞的ALP活性(P<0.01),HPS-1(10、20、50μg/mL)显著升高ROBs细胞的ALP活性(P<0.05、0.01);HPS-3(50μg/mL)显著升高rBMSCs细胞的ALP活性(P<0.05),HPS-2对2种细胞ALP活性没有促进作用。HPS-1显著增加rBMSCs和ROBs细胞中钙化结节面积和数量(P<0.01),HPS-2和HPS-3对rBMSCs和ROBs细胞钙化结节的形成没有促进作用。结论HPS-1可增强rBMSCs和ROBs细胞ALP活性和成骨相关因子表达,并显著促进rBMSCs和ROBs细胞分化、矿化。