丙型肝炎病毒优势表位抗原不同嵌合表达蛋白的血液反应性研究

目的：采用含HCV不同优势表位抗原进行连接表达，对20份血清进行对比检测，探讨血清反应性。方法：构建原核融合表达载体pBVIL-1，精选出HCV主要表位抗原插入表达载体在E.coli中表达，纯化后的融合抗原包被酶联板，用ELISA方法进行测定。结果：不同抗原组合连接（HCV NS4－Core、NS4-Core-NS3、NS4-Core-NS5AB-NS3)对血清的反应性不同。结论：含有多个抗原表位的嵌合抗原，能提高检测的灵敏度。     

丙型肝炎病毒非结构区3（NS3）I、Ⅱ型血清反应性的比较研究

目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）非结构区3（NS3）I型、Ⅱ型血清反应性。方法：利用表达载体PBVIL1对HCV全长NS3区I型、Ⅱ型抗原表位进行克隆表达，经纯化获得电泳纯的抗原。经酶联免疫吸附（ELISA）的方法检测丙型肝炎179份总抗体可疑阳性血清，再用NS3区I、Ⅱ型抗原进行相应抗体检测。结果：通过测定HCV－NS3区I型、Ⅱ型抗体，179份HCV－NS3区I型阳性检出105份，HCV－NS3区Ⅱ型阳性检出95例。结论：重组表达的HCV－NS3 I型、Ⅱ型抗原对丙型肝炎病毒血清反应略有不同。二者具有一定的互补性。     

丙型肝炎病毒非结构区 3(NS3)Ⅰ、Ⅱ型血清反应性的比较研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构区3(NS3)Ⅰ型、Ⅱ型血清反应性.方法利用表达载体PBVIL1对HCV全长NS3区Ⅰ型、Ⅱ型抗原表位进行克隆表达,经纯化获得电泳纯的抗原.经酶联免疫吸附(ELISA)的方法检测丙型肝炎179份总抗体可疑阳性血清,再用NS3区Ⅰ、Ⅱ型抗原进行相应抗体检测.结果通过测定HCV-NS3区Ⅰ型、Ⅱ型抗体,179份HCV-NS3区1型阳性检出105份,HCV-NS3区Ⅱ型阳性检出95例.结论重组表达的HCV-NS3 Ⅰ型、Ⅱ型抗原对丙型肝炎病毒血清反应略有不同.二者具有一定的互补性.     

生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达

为了建立丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的双抗原夹心ELISA检测方法．克隆表达带有生物素标签的Hcv多种抗原优势表位融合蛋白，选取HCV各抗原如Core，NS3，NS4，NS5和E的优势抗原表位片段编码序列．克隆重组为融合基因，插入Pinpoint^TM Xa-1 T载体中诱导表达，并用Western blot进行抗原性及标签生物素活性鉴定；表达抗原经Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin系统亲和层析纯化后包被酶联板，用抗HCV单片段抗体阳性血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ELISA法鉴定。结果显示：成功构建了带有生物素标签的HCV多抗原表位融合基因表达载体，该载体可在JM109(DE3)中可溶性表达目的蛋白，表达产物携带生物素标签，融合的各片段区均具有良好的抗原性。结论：所构建融合抗原可可溶性表达，可以用作双抗原夹心ELISA的酶标抗原．所含生物素标签也可用作酶联检测的生物素一亲和素信号放大系统。     

丙型肝炎病毒不同编码区重组抗原在抗体检测中的应用

目的　探讨丙型肝炎病毒 (HCV)不同编码区重组蛋白片段的免疫反应性及其在抗体检测中的应用。方法　分别以 4种HCV单片段抗原 (C、NS3、NS4或NS5 )检测抗 HCV抗体阳性血清 ;以 4种单片段抗原的混合物 (MIX)检测抗 HCV抗体阳性血清、大学生体检血清和抗 HCV抗体阴性质控血清。结果　 90份抗 HCV抗体阳性血清中共有 75份可与一种或多种单片段抗原反应 ,阳性率分别为 70 .0 % (C)、6 1.1% (NS3)、5 2 .2 % (NS4 )、4 4 .4 % (NS5 ) ,其中仅与C、NS3、NS4和NS5一种抗原发生反应的分别有 8份、1份、2份和 3份血清标本 ;90份抗 HCV阳性血清经MIX抗原检测 ,阳性率为 83.3% (75 / 90 ) ;10 0份大学生血清和39份阴性质控血清经混合抗原检测均阴性。结论　HCV不同编码区重组蛋白片段有不同的免疫反应性 ,在发展抗 HCV抗体诊断试剂时 ,应采用各种不同编码区的混合抗原。     

型别特异性丙型肝炎病毒嵌合抗原在血清分型中的应用

目的克隆表达型别特异性丙型肝炎病毒HCV 1b、2a嵌合抗原,并用于HCV血清分型检测。方法分别对HCV 1b、2a的C区和NS4区进行表位预测,选取优势表位序列连接后,于PGEX-4T-2载体中克隆表达嵌合的HCV 1b、2a抗原,应用竞争抑制酶联法对44份HCV 1b和18份2a血清进行血清分型检测。结果 62例血清样品中50例能分型,其中1b型34例,2a型16例,其分型率为80.6%(50/62),与基因型的符合率为90.0%(45/50)。结论丙型肝炎病毒HCV 1b、2a嵌合抗原用于HCV的血清分型检测,具有较高的准确率和分型率,可用于HCV血清分型检测。     

检测HCV分片段抗体对提高HCV感染临床诊断率的应用研究

目前国内使用的抗HCVELA试剂均经过中国药品生物制品检定所的审批鉴定 ,具有较好的灵敏性和特异性。但是 ,由于各试剂厂家使用选择的不同片段抗原 (HCV C、NS3、NS4 、NS5)优势表位不同 ,使用的表达载体及后期纯化工艺也有所不同 ,使得融合抗原中各片段抗原的活性存在一定的差异 ,最终造成试剂盒存在不同程度的漏检。为进一步减少漏检率 ,提高临床诊断率及输血的安全性 ,我站采用HCV分片段抗体检测来确认常规抗HCV阳性的准确性 ,得到了较好的结果。1　资料与方法1 .1　一般资料　HCV RNA阳性及抗HCV阳性标本来自唐山市传染病医…     

丙型肝炎病毒抗体单片段检测与总抗体检测的比较分析

目的通过对国产HCV抗体分片段酶联免疫检测试剂与进口第三代抗HCV检测试剂检测丙型肝炎病毒抗体的研究来了解丙肝病毒抗体单片段检测的意义。方法采用国产基因重组表达的丙型肝炎病毒不同区(C、NS3、NS4、NS5)特异性抗原分别包被酶标板,以间接EIA法检测75例丙肝患者血清中不同区特异性抗体,并以Abbott公司第三代抗HCV试剂进行总抗体检测,同时做HCVRNA检测。结果75例血清中HCV不同区抗原片段NS3、HCVC、NS4、NS5的抗体检出率分别为933%(7075)、920%(6975)、707%(5375)、640%(4875),含两个片段以上的抗体检出率为947%(7175);抗HCV总抗体的检出率为987%(7475);HCVRNA检出率为774%(5875)。结论HCV不同区抗原片段的抗体检出率有差别,NS3、HCVC检出率较高,其次为NS4、NS5。两种试剂有较好的相关性,HCV抗体单片段试剂可作为检测丙型肝炎病毒抗体的补充试剂,单独片段抗体阳性具有一定意义,动态观察NS3、NS4抗体水平可预测IFN的治疗效果。     

献血人群中丙型肝炎病毒第1高变区抗体检测及意义

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)第一高变区(HVR1)抗体检测在献血者血液筛查中的意义。方法采用融合F4HVR1抗原检测不同血清样本中的抗-HVR1的存在情况,并与现有C、NS3、NS4、NS5抗体进行比较。结果在HCV-RNA阳性样本中,HVR1抗体的阳性率为96.8%;在90份可疑HCV感染血清中HVR1抗体的阳性率为61.1%,与C区、NS3区接近,高于NS4区、NS5区(P<0.05),共检测出4份单独HVR1抗体阳性血清。结论在现有HCV诊断试剂基础上,对献血人群进行HCV-HVR1抗体的检测可以提高血液筛查灵敏度,减少HCV的经血传播。     

HCV-NS3抗原基因的克隆表达及活性测定

[目的]研制新的更符合我国HCV感染株的NS3抗原，以进一步提高HCV免疫检试剂的灵敏度。[方法]对HCV／NS3（1192-1457aa）片段序列进行在线Blast分析，根据共有序列（consensus）设计并合成引物。以Trizol法从病人血清中提取总RNA，经反转录PCR扩增获得NS3相应目的基闪，插入载体、经测序正确后，克隆表达，表达产物经纯化后用间接ELISA法测定其反应活性。[结果]从病人血清中获得了NS3部分基闪片段，测序证明所获得的序列和我们以前的la型NS3序列有18个不同的氨基酸残基。重组新NS3抗原经活性测定，反应灵敏度有较大提高。[结论]新获得的HCV-NS3可用于试剂盒抗原，以提高对我国HCV感染病人检测的灵敏度。     

慢性丙型肝炎患者HCV不同功能区抗体的随访研究

目的　探讨慢性丙型肝炎患者不同功能区抗体的免疫应答。方法　利用基因重组克隆表达丙型肝炎病毒HCV c、NS3、NS4、NS5和HVR1抗原 ,分别包被酶联板 ,以间接ELISA法检测 1991～ 2 0 0 2年采集的 5 8名丙型肝炎患者的 14 4份血清不同功能区抗 HCV。结果　其中 5 0名 (86 .2 0 % )慢性丙型肝炎患者血清 5种相应抗 HCV呈持续阳性。结论　慢性丙型肝炎患者体内HCV c、NS3、NS4、、NS5和HVR1抗体无明显变化 ,未发现这 5种抗体与自愈的关系。     

DsbC介导HCV优势抗原表位原核可溶性表达与间接ELISA分析

目的 DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法 通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合后在原核系统内可溶性表达并纯化获得重组抗原DsbC-P367,建立HCV-IgG血清学检测方法,通过对HCV阴阳性血清的检测,评价DsbC-P367与P367在血清学诊断差异,获得一种新型HCV-IgG血清学诊断抗原制作方法。结果 通过信息学软件筛选获得的优势抗原表位来源于不同基因型,全长367个氨基酸。通过原核表达系统发现,DsbC-P367以可溶性表达形式存在,亲和纯化后其相对分子质量为63×10³,纯度为92%,Western blot实验初步证实重组DsbC-P367与P367蛋白均具有抗原性;对100份明确HCV阴阳性血清进行检测,DsbC-P367与P367灵敏度分别为96%、90%,特异度均为100%,与“金标准”比较,McNemer检验显示均P=1.00,Kappa分别为0.95、0.87,提示DsbC...     

部分ELISA抗-HCV阴性和阳性血清丙肝抗体分片段检测分析

目的　探讨ELISA抗 HCV检测的血液丙肝不同基因抗体的反应性和血液HCV感染的具体情况。方法留取本站抗 HCV阴性血清 1 6 8份、阳性血清 80份、可疑血清 6 2份 ,分别进行丙肝分片段检测 ,检测阳性的血清再进行HCVRT PCR检测。结果　 1 6 8份阴性血清、80份阳性血清及 6 2份可疑血清中不同基因抗体的阳性数分别为 3份、76份和 2 4份 ,HCVRT PCR的阳性结果分别为 0份、5 7份和 1 1份 ,两个以上片段检测结果阳性的血清与RT PCR结果高度符合 ,单独C区和NS3阳性的血清仍有一半以上RT PCR结果阳性 ,1例NS5阳性的血清RT PCR检测阳性。结论　HCV C和NS3抗体是抗 HCV阳性的主要血清标志 ,但NS4和NS5抗体在抗 HCV检测中也具有重要意义     

HCV多表位复合抗原基因表达条件的探索

目的:筛选出适合HCV多表位复合抗原基因(PCX)表达的菌株,优化表达条件,并进行目的蛋白的免疫特异性的检测.方法:将含HCV多表位复合抗原基因的重组质粒pWR450-PCX转入大肠杆菌DH5α、TOP10F’、BL21菌株中,在不同培养基中,经不同浓度IPTG诱导不同时间,表达融合蛋白(GZ-PCX),并利用患者阳性血清通过Western Blot检测其免疫特异性.结果:重组质粒在DH5α、TOP10F’菌株中均能表达有一定免疫特异性的目的蛋白,但BL21中不表达;目的蛋白在TB培养基中的表达量明显高于LB培养基.结论:在37℃,IPTG浓度为1 mM诱导3h时,目的蛋白的表达量达到峰值;所制备的抗原具有一定的免疫特异性和免疫原性.     

重叠延伸PCR法构建HCV多表位嵌合抗原

[目的]构建具有免疫活性的HCV多表位嵌合抗原。[方法]选取带有优势抗原表位区域的4段HCV多肽和-段HER-2多肽，找出对应碱基序列，扩增目的基因。然后通过重叠延伸PCR（OE-PCR）法将扩增的目的基因拼接，并克隆到原核表达载体中进行表达、纯化和活性检测。[结果]重叠延伸PCR法构建原核表达载体成功，其所表达的HCV-HER-2嵌合抗原为包涵体表达，经纯化和复性后具有良好的抗原活性。[结论]成功地构建了HCV多表位嵌合抗原，并表达和纯化了目的蛋白，确定了其抗原活性。     

HCV NS3诱导小鼠特异性T细胞反应的抗原多肽序列筛选

目的 筛选HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽序列.方法 BALB/c小鼠用HCV NS3加po-ly （I∶C）或CpG ODN及Montanide ISA720佐剂免疫后,分离其脾淋巴细胞,以覆盖HCV NS3全基因的合成重叠多肽组成的不同多肽库进行刺激,以ELISPOT及流式细胞术检测分泌干扰素γ（IFN-γ）的细胞数及CD8＋/IFN-γ＋细胞或CD4 ＋/IFN-γ＋细胞百分比,确定抗原性最强的多肽库,找出HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽.结果 通过ELISPOT及流式细胞术检测,能够刺激淋巴细胞分泌IFN-γ最多及CD8 ＋/IFN-γ＋细胞或CD4＋/IFN-γ＋细胞百分比最高的多肽被选出作为阳性多肽,其中的一个多肽经进一步的ELISPOT及流式细胞术检测确认,其序列为GGCSGGAYDⅢCDECHS.结论 HCV NS3小鼠T细胞表位序列的确定为HCV疫苗的研究打下了基础.     

HCV单片段抗原EIA与常规EIA检测丙型肝炎病毒抗体的比较

目的比较国产重组HCV单片段抗原酶免疫(EIA)检测试剂与国产第三代HCV常规抗体(EIA)检测试剂的敏感性和特异性。方法利用基因工程技术重组表达的HCV单片段(HCV-C、NS、NS4、NS)EIA检测试剂和常规EIA试剂检测国家第三代抗-HCV血清考核盘(40份阳性和40份阴性血清样品)及20份不符血样，对检测结果进行统计分析。结果HCV单片段EIA检测试剂总符合率100％，常规试剂为96．2％。结论HCV抗体单片段试剂可作为对HCV常规EIA试剂检测不符血样的确认试剂。     

一种结核杆菌融合抗原的克隆表达及活性测定

目的进一步分析优化结核杆菌抗原优势表位,获得高特异性融合抗原,以满足研制结核病检测试剂的需要。方法用分子生物学软件分析结核杆菌四种抗原MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的优势表位后,分别插入到pBVIL1载体中,构建表达质粒,并利用pBVIL1载体特点,将其基因连接后,进行融合表达,经纯化获得抗原,用间接ELISA法测其活性。结果各抗原优势肽段及融合抗原均获得了高效表达,融合抗原的特异性和灵敏性均高于各单一肽段。结论此融合抗原可用于研制结核病的诊断试剂。     

蛋白芯片检测丙型肝炎病毒分片段抗体

目的用蛋白芯片的方法检测丙型肝炎病毒(HCV)分片段抗体。方法利用生物芯片技术和化学发光技术将高度纯化的抗原HCV Core、NS3、NS4、NS5以特定微阵列固定在固相载体上,用化学发光免疫法检测抗HCV Core、抗HCV NS3、抗HCV NS4和抗HCV NS5。结果174份血清中HCV抗体阳性87份,HCV抗体阴性87份,其中献血员33份,非丙型肝炎的其他肝病患者39份,非肝病者15份。87例雅培公司的AxSYM(微粒子发光)检测抗HCV阳性患者中,蛋白芯片检出阳性85份,阳性率为97.70%;在174份标本中,蛋白芯片检出阳性标本88份,其中抗HCV阳性87份,阳性率98.86%;抗HCV NS3检出49份,阳性率为55.68%;抗HCV NS4检出68份,阳性率为77.27%;抗HCV NS5检出37份,阳性率为42.05%;抗HCV Core检出69份,阳性率为78.41%。结论蛋白芯片显示较高的敏感性和特异性,具有临床实用价值。     

HCV细胞感染模型的建立

目的研究人宫颈癌细胞（Hela）对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性，建立HCV细胞感染模型。方法将Hela细胞与慢性HCV患者血清共同温育8h，收集不同时间点标本，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分别检测细胞培养上清液中正负链RNA，S-P法检测细胞内HCV NS1特异性抗原的表达情况。结果培养上清中可持续检测到HCV正链RNA，并可间断地检测到HCV负链RNA；HCV NS1特异性抗原能在感染细胞内稳定表达，阳性物质多位于胞浆中。结论Hela细胞不但对HCV易感，而且可以支持HCV体外复制表达。