ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

斑马鱼mcm5基因的表达分析及在体节发生中的功能

目的细胞周期因子MCM5在DNA复制起始中起着关键性作用,并参与基因转录调控,但其在胚胎发育中的作用鲜有报道。本文首先研究mcm5在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,然后对mcm5在斑马鱼体节发生中的作用进行研究。方法通过原位杂交的方法分析mcm5在斑马鱼发育早期的表达谱,然后运用MO注射的方法敲降mcm5功能,并结合原位杂交的方法分析mcm5在体节发生中的作用。结果整胚原位杂交实验显示,MCM5为母源性因子。在胚胎1细胞期到体节发生早期,mcm5呈广泛表达;从胚胎发育4体节开始,mcm5开始在尾牙、体节、头部区域呈现特异性表达,暗示其可能参与了体节发生的调控。在mcm5功能敲降时,活体胚胎除体轴变短、眼睛变小以外无明显畸形。但原位杂交实验显示体节发生相关标记性基因表达减弱,表明mcm5可能参与了体节发生的调控。结论在斑马鱼早期发育中mcm5参与了体节发生的调控。     

斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定

目的 由于原肠期细胞的剧烈运动,在斑马鱼胚胎的背侧汇聚形成了称为胚盾（Shield Organizer）的结构,是胚胎发育的信号组织中心,在背腹轴建立和胚层诱导过程中具有关键作用。系统鉴定在胚盾特异表达的基因,可为进一步探讨胚盾形成的机制及其指导胚胎早期发育的分子机理提供参考。方法 Tg(gsc:GFP)转基因鱼在胚盾表达特异的绿色荧光。通过流式细胞分选技术分离富集GFP阳性细胞并提取总RNA进行RNA深度测序,检测可能在胚盾高水平表达的基因。然后利用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和原位杂交技术鉴定若干在胚盾特异表达的基因。结果 从Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集到了纯度超过96%的GFP阳性细胞,RNA深度测序的结果显示有657个基因的表达水平比整胚细胞或GFP阴性细胞高2倍以上。最后,确认了KIAA1324,ripply1,twist2,isthmin1,nme4,zgc174153,rrbp1b等7个基因在胚盾特异表达。结论 系统鉴定到了斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因,为下一步研究这些基因的发育生物学功能奠定了基础。     

Daxx在斑马鱼胚胎发育中的作用及其机制研究

目的明确死亡结构域相关蛋白（Daxx）在斑马鱼胚胎发育过程中的时-空表达谱,并研究其作用与机制。方法利用原位杂交技术检测Daxx的表达谱;利用吗啉反义寡核苷酸介导的基因敲减技术敲低Daxx的表达,观测斑马鱼胚胎发育情况,并用pH3和TUNEL染色检测Daxx敲低后细胞增殖及凋亡的改变;通过Real—TimePCR实验研究Daxx影响细胞凋亡和胚胎发育的分子机制。结果敲低Daxx后斑马鱼胚胎细胞凋亡和畸形率显著增加,这一表型能被p53蛋白共敲低所恢复;在分子机制上,Daxx敲低可不同程度特异性激活bax、mdm2、p21和cyclinG1等p53下游多个基因的表达,Daxx富含酸性氨基酸的功能区介导rjj述过程。结论Daxx利用其自身结构域与p53作用,并特异调控其下游关键基因的表达,参与调节斑马鱼胚胎细胞凋亡和形念发育。     

Supervilin通过Wnt/β-catenin通路调控斑马鱼胚胎集中延伸运动

目的探究Supervillin在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及分子机制。方法利用Clustal Omega和DNAman软件,分析比较斑马鱼Svil和人类SVIL氨基酸序列同源性。利用RT-PCR和原位杂交技术,分析斑马鱼Svila(Svil蛋白在斑马鱼体内的亚型)在早期胚胎发育中的表达模式。注射反义吗啡环寡核苷酸链(MO),抑制斑马鱼中Svila表达,观察胚胎形态变化。通过Western Blot技术检测β-catenin蛋白表达与核定位情况,并用RT-PCR检测Wnt/β-catenin靶基因表达。结果在斑马鱼早期胚胎发育过程中,Svila属于母源性表达,随着发育时间呈表达上升趋势。利用MO降低Svila表达,斑马鱼胚胎发育发生畸变,体轴弯曲,可能与胚胎集中延伸运动受阻有关。Svila的表达影响β-catenin的核转运及Wnt/β-catenin信号通路激活。结论 Svila通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控斑马鱼早期胚胎的集中延伸运动。     

斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性...     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响

目的:探讨结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:利用实时定量RT-PCR和原位杂交方法检测结蛋白在胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射特异性反义寡核苷酸进行敲降,利用原位杂交和实时定量RT-PCR方法检测各胚层标志基因表达的变化?结果:结蛋白低水平表达起始于囊胚期,自神经胚期起表达量增加,在随后的发育阶段持续高表达;结蛋白敲降导致胚孔闭合延迟,胚层相关标志基因的表达受抑制?结论:结蛋白自囊胚期起表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,敲降结蛋白导致胚胎发育迟缓,胚层分化受抑     

MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏环化的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase 21,MMP21)基因表达下调对斑马鱼胚胎发育的影响.方法 在斑马鱼胚胎1～2细胞期采用显微注射吗啡啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotides,MO)的方法下调MMP21基因的表达.10体节期用RT-PCR方法检测MMP21-MO的有效性.设置0.5、0.75、1 mmol/L和1.5 mmol/L 4个不同浓度梯度的MMP21-MO注射组,以标准对照吗啡啉反义寡核苷酸(Con-MO)注射组和野生型(WT)组为对照.体视显微镜下观察各组斑马鱼胚胎发育情况,统计分析不同注射浓度斑马鱼胚胎死亡以及畸形数量.整胚原位杂交检测心脏特异性标志物(cardiac myosin light chain 2,cmlc2)在受精后28 h(hours post fertilization,hpf)及受精后48 h的表达,体视显微镜下观察受精后72 h斑马鱼胚胎心脏,分析各时间点斑马鱼心脏环化情况.通过计数各组斑马鱼胚胎受精后24、48及72 h心率和测量各组胚胎受精后72 h时心室收缩分数(ventricular shortening fraction,VSF),评价MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏功能的影响.结果 MMP21-MO能够有效抑制MMP21基因的表达.MMP21-MO对斑马鱼胚胎发育的影响存在一定的剂量反应关系.1 mmol/L MMP21-MO注射组胚胎畸形率最高,死亡率较低,畸形主要表现为心前区水肿、心脏环化异常、心脏搏动减弱和心率减慢.整胚原位杂交结果显示MMP21基因的表达下调导致心脏特异标志物cmlc2 mRNA在受精后28 h和受精后48 h时期异常表达,提示心脏环化前期阶段(cardiac jogging)和心脏环化(cardiac looping)过程异常.受精后72 h体视显微镜下观察斑马鱼心脏形态同样发现MMP21-MO注射组斑马鱼心脏环化异常.与对照组比较MMP21-MO注射组胚胎心率减慢,心室收缩分数下降.结论 MMP21基因表达下调导致斑马鱼心脏环化异常及心功能受损,MMP21基因可能在斑马鱼心脏环化过程中发挥重要作用.     

MIA影响非洲爪蟾胚胎中胚层的形成

目的:探讨黑色素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)在非洲爪蟾早期胚胎发育中的作用?方法:根据热带爪蟾MIA序列在非洲爪蟾EST数据库中找到MIA序列,利用RT-PCR扩增全长序列并克隆至pCS2+,用于测序?利用RT-PCR检测胚胎发育各阶段MIA mRNA的表达?通过显微注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)敲降MIA;利用整胚原位杂交检测胚层标志性基因的表达?结果:克隆出非洲爪蟾MIA全长序列?在胚胎发育过程中MIA从受精卵开始持续表达?敲降MIA导致胚胎胚孔闭合延缓,中胚层标志基因xbra表达明显受抑,而内胚层标志性基因sox17α表达无明显改变?结论:MIA表达于非洲爪蟾胚胎发育各阶段,敲降MIA抑制中胚层的形成?     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

Polycomb家族基因Nspc1在斑马鱼早期发育的表达

目的探讨Polycomb家族基因Nspc1在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式。方法根据GenBank中斑马鱼Nspc1的cDNA序列设计Nspc1原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针。收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果。结果在斑马鱼体节期前,Nspc1在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达。结论Nspc1在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色。     

叶酸挽救乙醇致斑马鱼胚胎心脏和流出道发育异常

 目的  观察乙醇对斑马鱼胚胎心脏和流出道发育的干扰作用,并初步探讨叶酸挽救乙醇所致心脏和流出道发育异常的最佳时段和可能机制。方法  在斑马鱼胚胎发育不同时段予以乙醇处理,观察胚胎的发育异常情况。将受精后7~12 h被予以乙醇组定义为乙醇处理组。在乙醇处理组胚胎的发育不同时段给予外源性叶酸进行叶酸挽救实验,观察各叶酸干预组胚胎的发育状况,探寻叶酸挽救的最佳时段。将受精后7~12 h给予叶酸组定义为叶酸挽救组。观察并统计乙醇处理组以及叶酸挽救组的胚胎发育异常百分比、存活百分比、心脏和流出道形态及其异常百分比、心率、心室收缩指数等指标来评估胚胎的发育状况。利用荧光显微造影的方法探查心脏流出道形态,采用胚胎整体原位杂交和real-time PCR 方法检测胚胎bmp2b、tbx1的表达情况。结果  乙醇可干扰胚胎发育,乙醇处理组胚胎存在明显心脏和流出道形态异常以及心功能损害,在胚胎发育早期乙醇的干扰作用最明显。给予外源性叶酸能挽救乙醇导致的胚胎发育异常,在胚胎受精后7~12 h叶酸挽救作用最显著。乙醇处理组胚胎心脏和流出道的bmp2b、tbx1表达下降;予以叶酸干预后,乙醇处理组胚胎bmp2b和tbx1表达水平上调。结论  叶酸能有效挽救乙醇导致的心脏和流出道发育异常,其机制可能是上调乙醇处理组胚胎bmp2b、tbx1的表达水平。     

Midkine-a通过限制心肌细胞总数的方式阻碍斑马鱼胚胎心脏生长

目的 探讨一种可溶性的外分泌因子Midkine-a在斑马鱼胚胎心脏发育过程中的功能。方法 在整体胚胎上做Midkine-a RNA的原位杂交实验;利用原有的转基因斑马鱼系Tg (pMidkine-a:EGFP),动态观察胚胎从出生到心脏发育成形这一段时间心脏荧光表达情况;将原有的转基因斑马鱼体系 Tg (phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎进行热休克而过表达Midkine-a,观察胚胎心脏表型;利用Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎的心肌细胞核带有红色荧光,能进行单个心脏心肌细胞计数这一特点,将杂合的Tg (phsp:Midkine-a:EGFP)鱼系与纯合的Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系交配,以得到Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)的杂合胚胎,对其进行热休克而过表达Midkine-a,计算每个胚胎心脏内心肌细胞的总数; 用吗啉寡聚核苷酸 （Morphonino,MO）阻碍新生胚胎内的Midkine-a mRNA 表达,观察胚胎心脏表型。结果 原位杂交试验证实Midkine-a在胚胎48hpf （hours post fertilization, 受精后小时,用来标记斑马鱼胚胎年龄）大时表达于心脏;转基因Tg (pMidkine-a:EGFP)胚胎在72hpf时其EGFP表达于心脏;Tg(phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎在过表达Midkine-a后心脏变小;吗啉寡聚核苷酸敲除Midkine-a对胚胎心脏发育无影响;最后在Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎内过表达Midkine-a导致其单个心脏内心肌细胞数目变少,与其小心脏外形吻合。结论 Midkine-a在斑马鱼胚胎发育过程中表达于胚胎心脏;过表达Midkine-a导致胚胎心脏内心肌细胞总数减少及心脏变小;敲除Midkine-a则对胚胎心脏发育无影响。     

Clec14a基因调控斑马鱼胚胎血管发育*

目的：探索Clec14a在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能,探讨该基因调控血管发育机制。方法：通过胚胎整体原位杂交技术,观察Clec14a基因在斑马鱼胚胎期的表达情况;在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）和Tg（fli1a:nGFP）中,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholinoantisense oligos）下调Clec14a基因表达,同时在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）中注射Clec14a-mRNA调控Clec14a基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管（intersegment vessel,ISV）表型,统计分析内皮细胞迁移速度和数目的变化,并应用qRT-PCR技术检测下调后该基因mRNA表达情况。结果：在受精后24 h、48 h和72 h,Clec14a基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中有表达;Clec14a基因表达下调导致ISV发育缺陷,内皮细胞数目减少,抑制其迁移速度。结论：下调Clec14a基因表达能够通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。