hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质，然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布，并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加，并与内源性的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达水平一致。结论首次证实人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控，为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型。     

人hsp90β基因的诱导表达与染色质活化的关系

目的 研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法 采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质。然后采用狭缝杂交技术比较热诱地前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果 发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的ｈｓｐ９０β     

检测4种热休克基因表达水平的RT-PCR体系的建立及其应用

目的建立能同时检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA表达水平的RT-PCR体系。方法采用基因克隆、基因重组、体外转录、RT-PCR技术,建立能同时检测细胞中4种热休克基因的RT-PCR体系,并将此体系用于检测SW13细胞中热休克基因的表达。结果构建了用于4种热休克基因mRNA检测的内参照质粒,并经体外转录成内参照RNA(i-RNA);用于SW13细胞中结果显示:hsp70、hsp90α呈典型的热诱导表达,hsp60和hsp90β具有较高水平的组成性表达,并且呈不同程度的热诱导表达。结论新构建的RT-PCR体系可以用于检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA的表达水平。     

热休克诱导基因表达谱的变化

目的 研究细胞在热应激时的基因表达谱变化。方法 提取热休克前后Jurkat细胞的总RNA,经逆转录合成cDNA探针后分别与人cDNA表达占阵杂交,再用ESTblot软件进行分析,并用Northern印迹证明基因表达的改变。结果 经42℃1h热休克的细胞中有40个基因的mRNA表达升高,16个基因的mRNA表达降低,其中除热休克基因表达显著增加外,原癌基因c-Jun、cdc样激酶CLK－1基因表达明显增加。整合素integrin ∝－4基因,转化生长因子TGF－β基因表达显著降低。Northern印迹证明c-Jun及hsp90∝基因表达升高。结论 在热应激条件下Jurkat细胞热休克基因、c-Jun、CLK－1基因表达增加,integrin ∝－4基因、TGF－β基因表达减少。     

BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90α基因表达的增强作用

目的探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用.方法用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性.结果热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性.结论GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal veetor质粒上hsp90α CAT的表达.     

STAT1对hsp90α基因表达的负调控作用

目的探讨转录因子STAT1对hsp90α基因表达的调控作用.方法将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT-PCR定量检测其内源性hsp90α基因mRNA水平.共转染STAT1表达质粒和hsp90α基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因质粒,利用定量RT-PCR检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析方法检测42℃1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析(EMSA)检测STAT1与hsp90α5′基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度.结果STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90α基因的表达,又能抑制hsp90α基因5′上游调控区驱动的CAT报告基因活性.热激以前Jurkat细胞中的STAT1701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90α基因5′上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合.结论STAT1对hsp90α基因的表达具有负调控作用.     

热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达

目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-jun N端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程.方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态.用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响.结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1 h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%.转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制.GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平.结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化的Rac信号通路有调节作用.     

BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp900α基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomalvector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp900α CAT的表达。     

BTB／POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90a基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB／POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90a基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90a基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90a-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a CAT的表达。     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

染色质免疫沉淀技术及其在基因表达调控研究中的初步应用

目的验证抑癌基因表达产物p53蛋白在体内是否结合于p21WAF1/CIP1基因的启动子区,并检测p53蛋白对热休克蛋白hsp90β基因启动子区的结合情况.方法采用染色质免疫沉淀(ChIP)及PCR技术检测特异基因调节序列,Westem印迹分析p53蛋白.结果在p53抗体免疫沉淀的DNA片段中含有p21WAF/CIP1和hsp90β基因的启动子区p53蛋白结合序列,免疫沉淀样品中含有p53蛋白.结论p53蛋白在体内结合于p21WAF1/CIP1和hsp90β基因的启动子区,参与两基因的表达调控.     

血小板衍生生长因子受体-β信号促进突变型p53介导MDA-MB-231细胞阿霉素耐药

目的 探讨血小板衍生生长因子受体-β (platelet-derived growth factor receptor-beta, PDGFR-β)信号与三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞阿霉素耐药的关系及机制.方法 采用流式细胞术、MTS法检测PDGF-DD(PDGFR-β特异性配体)对阿霉素所致的细胞G2期阻滞、细胞凋亡及死亡情况的影响;qPCR和Western blot检测突变型p53、cdk1、PDGFR-β、p21、bax、hsp90及TopBP1表达水平,以研究PDGF-DD、Wortmannin(PI3K抑制剂)对突变型p53及其功能的影响;利用siRNA干扰技术、qPCR探讨突变型p53、PDGF-DD和耐药相关基因表达的关系.结果 PDGF-DD明显提高阿霉素条件下细胞存活率、降低细胞凋亡率、一定程度改善细胞G2期阻滞,显著提高突变型p53蛋白水平并改变其下游基因cdk1、PDGFR-β、p21、bax表达,但突变型p53 mRNA变化差异不具统计学意义(P＞0.05).PDGF-DD显著上调hsp90(突变型p53蛋白稳定因子)和TopBP1(突变型p53功能促进蛋白)mRNA和蛋白水平,Wortmannin处理后表达明显下降.PDGF-DD明显提高耐药相关基因FOXC2、twist、snail、nanog、oct4 mRNA水平,p53 siRNA处理后mRNA表达显著下降.结论 PDGF-DD/PDGFR-β信号能诱导MDAMB-231细胞发生阿霉素耐药,通过PI3K途径转录水平上调hsp90和TopBP1表达、稳定并促进突变型p53介导细胞耐药是其重要机制之一.     

热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低的转录调控机制

目的:研究人的细胞周期素D1基因启动子热休克效应的表达调控机制.方法:以RT-PCR技术研究细胞周期素D1mRNA水平的变化;构建一系列人细胞周期素D1基因启动子报告基因质粒.通过报告基因方法确认细胞周期素D1启动子的热休克效应区.应用染色质免疫沉技术检测核心启动子区域的组蛋白乙酰化修饰情况.结果:热休克造成细胞周期素D1mRNA水平下降;报告基因结果显示人细胞周期素D1基因的热休克的效应区位于-50～+141bp范围.核心启动子区组蛋白H3第九位赖氨酸乙酰化程度降低.结论:热休克抑制人的细胞周期素D1基因的启动子转录活性,其效应区位于核心启动子的-50～+141bp范围.热休克效应与核心启动子区的组蛋白乙酰化程度下降有关.     

靶向Hsp90β的siRNA对Jurkat细胞生长的抑制作用

目的 探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein 90 beta,Hsp90β)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用.方法 根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTM LTX 转染入Jurkat细胞后,Real-time PCR检测 Hsp90β mRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90β siRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对Jurkat细胞生长抑制作用.结果 成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染Jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90β mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05).Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%, 细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05).结论 靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用.     

缺氧诱导乳鼠心肌细胞hsp90a表达及变化

目的探讨缺氧后乳鼠心肌细胞中热休克蛋白90a(hsp90a)表达及变化规律,探讨hsp90a在缺氧心肌细胞中发挥的保护作用。方法采用建立的心肌细胞缺氧模型,蛋白免疫印迹法测定hsp90a蛋白表达变化水平,免疫组化法显示心肌细胞中hsp90a表达的定位。结果缺氧后乳鼠心肌细胞中hsp90a的表达明显升高且呈现出一定规律性。结论缺氧可以诱导心肌细胞中hsp90a的表达增加,其主要分布于心肌细胞浆内,作为一个重要的调控分子参与早期缺氧心肌细胞的保护机制。     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

p53反式结合hsp90β基因

目的 探讨hsp90β基因中p53结合位点（＋31／＋60）是否参与p53与hsp90β基因的反式结合,以进一步揭示该位点在p53调节hsp90β基因转录中的作用。方法 将含有p53结合位点的hsp90β基因片段插入质粒pBS-SK,然后将综与突变引物和选择引物一起依次退火和延伸,经过两 轮细菌转化,酶切筛选出突变阳性粒后进行序列分析。采用电泳迁移率变更测定（EMSA）检测突变后基因片段与转染p53表达质粒的Jurkat细胞核抽提物的结合。结果 序列分析证实p53结合。结论 hsp90β基因中p53结合位点的核心序列在p53与hsp90β基因的反式结合中关键作用。     

T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活基因表达的影响

目的:研究T细胞激活剂PHA,抗-CD3 mAb, PMA A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因(RAGs )mRNA表达水平的影响. 方法:采用RT-PCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat 细胞中RAG-1, RAG-2 mRNA,以β肌动蛋白(β-actin)的表达作为内参照进行灰度分析,比较不同组Jurkat细胞RAGs mRNA的表达水平 . 结果:三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG-1 mRNA表达量明显低于对照组(P＜0.05),且RAG-1 mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关;PHA刺激诱导后RAG-2表达量显著低于对照组(P＜0.05);PMA A23187刺激诱导6, 12 h均未检测出RAG-2 mRNA的表达; 而抗-CD3 mAb作用12 h组RAG-2 mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05). 结论:Jurkat细胞同时表达RAG1, RAG2 mRNA,并在一定诱导下RAGs表达量发生改变,因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.