5-氮-2’脱氧胞苷对急性粒细胞性白血病细胞系HL-60中CDH13基因甲基化的影响

目的分析探讨5-氮-2’脱氧胞苷对急性粒细胞性白血病细胞系HL-60中CDH1基因甲基化的影响。方法5-Aza-dC处理培养的HL-60细胞，用甲基化特异性PCR（MSP）法检测处理前后细胞中CDH13基因的甲基化状态，RT—PCR法检测用药前后细胞中CDH1mRNA表达的变化。结果HL-60中CDH13启动子区发现甲基化，应用5-Aza—dC能使CDH1基因启动子区CpG岛去甲基化，而且经药物处理后CDH13mRNA的表达较前明显增强。结论5-Aza—dC能逆转CDH13基因甲基化状态，从而调控CDH13基因表达。     

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对HL-60细胞株Galectin-1基因的表达及甲基化影响

目的 探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对HL-60细胞Galectin-1基因表达的影响,并进一步分析药物处理后Galectin-1基因启动子区域甲基化状态的改变. 方法用5 μmol/L的5-aza-2dC处理HL-60细胞,采用Real-Time RT-PCR检测Galectin-1基因在药物处理与未处理组中的mRNA表达水平,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)榆测Galectin-1基因启动子区域在药物处理与未处理HL-60细胞中的甲基化水平.结果 Real-Time RT-PCR结果显示Galectin-1在处理后的HL-60细胞中表达上调,MSP结果显示,HL-60细胞Galectin-1基因启动子区存在高甲基化,经5-aza-2dC处理后能够使Galectin-1基因去甲基化.使其甲基化水平下降. 结论启动子区域高甲基化是Galectin-1基因低表达的原因之一,5-aza-2dC能够使Galectin-1基因去甲基化,逆转Galectin-1基因的表达,5-aza-2dC可能在抗急性髓系白血病中发挥重要作用.     

5-氮-2'脱氧胞苷逆转人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因的表达

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne RIZ1基因启动子区甲基化状态及表达的影响,探讨人卵巢癌细胞系OVCAR3和AnglneRIZ1基因失活的机制及5-Aza-CdR对RIZ1基因表达的调控。方法:用5-Aza-CdR(浓度为5μmol/L)处理体外培养的人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne后,采用MSP法检测用药前后细胞中RIZl基因的甲基化状态,RT-PCR及Western-blot法检测用药前后细胞中RIZ1基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:在人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中,RIZ1基因启动子区呈异常甲基化状态,RIZ1基因mRNA及蛋白表达缺失,经过5-Aza-CdR处理后,RIZ1基因启动子区呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白重表达。结论:5-Aza-CdR可改变人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因甲基化状态,从而调控癌细胞中RIZ1基因的表达。     

甲基化抑制剂对肾癌细胞株中γ—caenin蛋白表达的影响

目的研究甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza—CdR）对人肾癌A498细胞增殖及^γ-连环蛋白（γ—catenin）表达的影响。方法使用不同浓度（10^-7、10^-6、10^-5mol／L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza—CdR处理A498肾癌细胞株。MTT检测5-Aza—CdR对。肾癌细胞株A498抑制作用。细胞免疫化学检测5-Aza—CdR处理A498肾癌细胞株后^γ—catenin表达的变化。结果5-Aza—CdR能明显抑制肾癌细胞的增殖,且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ-连环蛋白表达增加。结论γ-catenin蛋白表达受甲基化的抑制,提示5-Aza—CdR可使γ-catenin基因去甲基化而抑制A498肾癌细胞株增殖。     

抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与卵巢癌的关系

目的:探讨抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与卵巢上皮性癌发生的关系。方法:以卵巢癌组织及卵巢癌细胞系为研究对象。MSP检测RIZ1基因甲基化状况;RT-PCR、蛋白印迹分别检测RIZ1mRNA及蛋白表达;细胞增殖实验检测5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理卵巢癌细胞前后细胞的增殖状况。结果:卵巢癌组织、卵巢癌细胞系、良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织中的甲基化率分别为25.8%、40%、0%和0%。5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理RIZ1基因发生甲基化的卵巢癌细胞系后,RIZ1基因重新获得表达;且去甲基化处理后,卵巢癌细胞生长均减慢。结论:抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与上皮性卵巢癌的发生有关,DNA甲基化是其表达缺陷的原因之一。     

甲基化寡核苷酸灭活DKK3基因对肝癌细胞增殖的影响

目的 研究甲基化寡核苷酸灭活Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3,DKK3)基因对HepG2肝癌细胞增殖的影响。 方法 采用甲基化特异性PCR法检测肝癌细胞DKK3基因启动子甲基化状态。将寡核苷酸(分别为MON组、UMON组、CON1组和CON2组)转染HepG2肝癌细胞,比较转染后DKK3基因启动子甲基化状态、细胞增殖和凋亡的差异。 结果 HepG2肝癌细胞DKK3基因启动子未检测到甲基化,Hep3B、SMMC-7721和HuH-7肝癌细胞DKK3基因启动子处于甲基化状态。MON可成功诱导其互补序列CG位点产生甲基化,而UMON、CON1和CON2寡核苷酸无法诱导甲基化。UMON组、CON1组和CON2组HepG2肝癌细胞在D0-D6吸光度、G₀/G₁期、S期、G₂/M期、增殖指数(proliferation index,PI)和凋亡率方面差异均无统计学意义(均P>0.05);MON组HepG2肝癌细胞G₀/G₁期比例和凋亡率均显著低于UMON组、CON1组和CON2组(均P<0.05),而D1-D6吸光度、S期、G₂/M期和PI均显著高于UMON组、CON1组和CON2组。 结论 甲基化寡核苷酸可成功诱导DKK3基因甲基化,导致HepG2肝癌细胞细胞增殖增加而凋亡下降。     

纳米二氧化硅对HaCaT细胞中PAPR-1基因表达及其启动子甲基化的影响

目的 研究纳米二氧化硅(nm-SiO2)对人皮肤表皮细胞系(HaCaT)细胞中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 (poly[ADP-ribose] polymerase 1,PARP-1)基因的表达及其基因启动子区甲基化的影响.方法 分别以2.5、5.0、10.0 μg/ml的nm-SiO2溶液和10 μg/ml的微米级SiO2(micro-SiO2)溶液处理HaCaT细胞24 h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-CdR,DAC)处理48 h 10 μg/ml的HaCaT细胞为阳性对照(DAC组),并设立溶剂对照组(CTRL组).应用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹法(Western-blot法)检测PARP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化,应用亚硫酸氢盐测序(bisulfite pyrosequence,BSP)法检测PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化状态.结果 HaCaT细胞暴露nm-SiO2 24 h后,经nm-SiO2处理后,micro-SiO2染毒组和2.5μg/ml染毒组PARP-1表达与CTRL组的差异无统计学意义(P＞0.05),与CTRL组比较,5、10 μg/ml染毒组及DAC处理组细胞的PARP-1表达下调,差异有统计学意义(P＜0.05),且其下调水平随着浓度的增大而增高.BSP结果显示PARP-1启动子区-229点甲基化状态升高.结论 nm-SiO2可以降低HaCaT细胞中PARP-1基因的表达,可能与其对PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化影响有关.     

苯并[a]芘对人支气管上皮细胞CYP1A1、GSTP1和GSTM1 DNA甲基化水平和mRNA表达的影响

[目的]探讨苯并[a]芘(BaP)对人支气管上皮(16HBE)细胞中CYP1A1、GSTP1和GSTM1启动子区DNA甲基化水平和mRNA表达的影响,为BaP毒理学机制的研究提供科学基础。[方法]体外培养16HBE细胞,取对数生长期的同一批次细胞,随机分为4组,包括1个溶剂对照组和3个BaP处理组,分别用二甲基亚砜(DMSO)及1、2、5 mmol/L BaP处理24 h,于倒置显微镜下观察细胞的形态学改变。采用CCK-8试剂盒测定细胞增殖能力,甲基化特异性PCR法检测CYP1A1、GSTP1和GSTM1启动子区DNA甲基化水平,实时定量PCR技术检测CYP1A1、GSTP1和GSTM1 mRNA表达的改变。采用SPSS 22.0软件的单因素方差分析进行比较,LSD法进行多组间的两两比较。[结果]与溶剂对照组相比,1、2、5 mmol/L BaP处理组新生细胞数目明显增多,细胞增殖率增高,分别为(100.00±0.47)%、(125.22±0.72)%、(122.92±1.47)%、(128.44±5.97)%(P0.05)。3个BaP组CYP1A1启动子区甲基化水平分别为8.451±1.234、8.532±0.728、11.064±0.423,低于溶剂对照组(13.917±1.094)(P0.05)。3个BaP处理组GSTP1启动子区甲基化水平分别为4.276±0.839、3.691±0.748、2.121±0.336,也低于溶剂对照组(10.860±1.129)(P0.05)。GSTM1启动子区甲基化水平分别为34.693±6.603、48.407±7.824、49.803±2.516;其中,1 mmol/L BaP组低于溶剂对照组(40.062±7.746),2、5 mmol/L BaP组高于溶剂对照组(均P0.05)。3个BaP组CYP1A1 mRNA表达水平分别为0.009±0.001、0.009±0.001、0.017±0.003,低于溶剂对照组(1.067±0.064)(P0.05);GSTP1 mRNA和GSTM1 mRNA的表达水平分别为(0.179±0.074、0.167±0.048、0.143±0.029)和(0.547±0.181、0.518±0.141、0.297±0.044),均低于溶剂对照组(0.829±0.116、0.975±0.183)(P0.05)。[结论]BaP对16HBE的毒作用机制可能与其细胞增殖能力增强及CYP1A1和GSTP1启动子区DNA甲基化水平降低,CYP1A1、GSTP1、GSTM1 mRNA表达降低有关。     

5-氮杂胞苷对宫颈癌细胞FHIT基因去甲基化及抑制增殖作用

目的:探讨5-氮杂胞苷对Hela宫颈癌细胞脆性组氨酸三联基因(Fragile histidine triad gene,FHIT)启动子去甲基化作用及对其增殖的影响。方法:采用低浓度和高浓度5-氮杂胞苷作用Hela宫颈癌细胞,分别采用BSP和RT-PCR检测处理前后FHIT基因启动子甲基化状态和mRNA表达,应用MTT法检测细胞增殖改变。结果:Hela宫颈癌细胞FHIT基因启动子表现高度甲基化状态(CG位点甲基化率为80%～100%),mRNA表达完全受到抑制,细胞呈指数增殖状态;低浓度5-氮杂胞苷作用后的甲基化率显著降低(10%～40%),细胞增殖速度降低;高浓度组FHIT基因启动子甲基化状态被完全逆转,mRNA表达明显高于低浓度组,细胞增殖速度显著低于正常组和低浓度组。结论:5-氮杂胞苷可逆转Hela宫颈癌细胞FHIT基因甲基化状态,使基因恢复表达而抑制细胞增殖,去甲基化和抑制增殖作用随5-氮杂胞苷剂量增加而增加。     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2启动子区CpG岛的甲基化状态

目的探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中Foxa2的表达改变及其启动子区CpG岛的甲基化水平变化。方法按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞[第22代细胞,即22 PDL(populationdoubling levels,群体倍增水平)]组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组。用荧光定量PCR方法检测人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达改变,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测启动子区-777～-478 bp甲基化的变化情况,并用亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序检测启动子区域CpG岛的甲基化水平。结果与年轻细胞组比较,中年细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2 mRNA的表达水平无明显变化;而复制性衰老细胞组和早衰细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2的mRNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。早衰细胞组的启动子区具有一定的甲基化水平;年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰细胞组Foxa2启动子区CpG岛的甲基化水平分别为5.7%,17.1%和43.6%。结论人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达水平逐渐降低,其启动子区CpG岛甲基化水平逐渐升高,参与其表达调控。     

GSTP1和RASSF1A在前列腺癌组织中的甲基化检测及其表达研究

目的：研究前列腺癌和前列腺增生组织中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化差异及其蛋白表达情况,探讨GSTP1和RASSF1A基因甲基化作为前列腺癌早期诊断的价值,并揭示该基因甲基化与前列腺癌的发生发展的关系。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法检测GSTP1和RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态,并运用免疫组化SP染色法检测前列腺癌组织中GSTP1和RASSF1A基因的蛋白表达情况。结果：前列腺癌组织中GSTP1和RASSF1A基因甲基化检出率均明显高于前列腺增生组织,差异均有统计学意义（GSTP1：76.00%vs3.33%,P〈0.001;RASSF1A：68.00%vs16.67%,P〈0.001）。在前列腺癌中,GSTP1和RASSF1A蛋白阳性表达均明显低于前列腺增生组织,差异均有统计学意义（GSTP1：20.00%vs76.67%,P〈0.001;RASSF1A：38.00%vs90.00%,P〈0.001）。结论：GSTP1和RASSF1A基因异常甲基化可导致靶基因的蛋白表达降低,促进前列腺癌的发生发展。因此,GSTP1和RASSF1A基因在前列腺癌的发生、发展中起到重要作用,检测GSTP1和RASSF1A基因的甲基化有望成为前列腺癌早期诊断的分子标志物。     

苯中毒患者中抑癌基因p16高甲基化及其表达下调

目的研究苯是否通过引起DNA甲基化使抑癌基因p16转录失活。方法应用病例-对照研究对11名苯中毒患者和8名与苯中毒患者年龄(±5岁)、性别匹配,并且同工种同工龄的接苯但无苯中毒的对照进行检测。分别用实时荧光定量PCR及焦磷酸测序检测基因表达及甲基化水平。结果 p16的表达水平在苯中毒组(0.53)低于对照组(2.06)(P=0.064)。p16启动子区CpG位点甲基化平均水平苯中毒组(12.4%)高于对照组(11.3%)(P>0.05)。甲基化与基因表达水平相关分析发现,p16 CpG位点平均甲基化水平与基因表达水平负相关(pearson相关系数r=-0.64,P>0.05),其中p16启动子区第4个CpG位点位于嗅神经元转录因子共有结合序列内,其甲基化水平与基因表达水平显著负相关(pearson相关系数r=-0.88,P<0.05)。结论在苯中毒患者中p16的表达水平显著降低,基因启动子区CpG岛的高甲基化可能与该基因的低表达有关。需要进一步扩大样本量深入研究苯相关疾病抑癌基因表达异常的分子机制。     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中胰岛素样生长因子2表观遗传活化作用

目的观察体外培养人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导早衰持续阶段胰岛素样生长因子2(IGF2)表观遗传学修饰。方法荧光定量PCR检测IGF2的mRNA表达,甲基化特异PCR检测其启动子区甲基化改变,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化,H3(Lys4)及H4(Lys20)甲基化修饰。结果细胞复制性衰老过程中,中年细胞组及复制性衰老细胞组IGF2的mRNA表达升高,早衰持续组升高显著;细胞衰老过程中,仅复制性衰老细胞组在启动子区-658～-456bp具有一定的甲基化水平;复制性衰老细胞组的组蛋白修饰在启动子区-856～-634bp以H4乙酰化,H3甲基化修饰为主;+9～+145bp的修饰,复制性衰老细胞组受组蛋白H3及H4甲基化联合修饰,早衰持续组以H3甲基化修饰为主。结论细胞衰老过程中,IGF2启动子区组蛋白修饰联合调控其mRNA表达,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异。     

急性白血病错配修复基因表达及启动子甲基化

目的探讨急性白血病患者DNA修复基因(hMSH2和hMLH1基因)mRNA、蛋白表达情况及其启动子甲基化状态。方法选取56例急性白血病患者和30名健康志愿者,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(western blot)检测其单个核细胞错配修复基因hMSH2和hMLH1的mRNA及蛋白表达,用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测hMSH2和hMLH1启动子区甲基化状态。结果与健康志愿者组比较,急性白血病患者的错配修复基因hMSH2和hMLH1均明显低表达,差异有统计学意义(P<0.05);急性白血病患者hMSH2和hMLH1甲基化阳性率为66.1%(37/56)和55.4%(31/56),明显高于健康志愿者的10.0%(3/30)和6.7%(2/30),差异有统计学意义(P<0.05);急性白血病患者hMSH2和hMLH1表达与其甲基化状态呈负相关性(rhMSH2=-0.624,P=0.000;rhMLH1=-0.589,P=0.002)。结论急性白血病患者的hMSH2和hMLH1基因呈低表达,其启动子呈高甲基化水平,急性白血病患者hMSH2和hMLH1基因表达低下与其启动子甲基化状态有关。     

燃煤污染型砷中毒人群MGMT基因甲基化、转录及表达的研究

目的了解O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT基因)启动子区甲基化、转录及表达以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的转录及表达与砷中毒的关系。方法采集68例燃煤污染型砷中毒(以下简称砷中毒)患者(轻度24例、中度28例、重度16例)及23例非病区居民外周血。用甲基化特异性PCR法(MSP)检测MGMT基因启动子区甲基化,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测MGMT及DNMT1 mRNA的水平。利用自愿手术治疗的砷中毒患者皮肤组织标本(61例,其中34例为一般病变,21例为癌前病变,6例为癌变)和对照皮肤组织标本(15例),以免疫组织化学(IHC)法检测砷中毒患者及对照皮肤组织中MGMT及DNMT1蛋白的表达。结果 MGMT基因启动子区甲基化阳性率与砷中毒程度有关(χ2=13.739,P0.01)。砷中毒组MGMT mRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);MGMT基因启动子区甲基化患者和非甲基化患者之间MGMT mRNA和DNMT1 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。但轻、中度患者DNMT1 mRNA表达明显低于对照组(P0.01);癌前病变组和癌变组皮肤组织中MGMT蛋白表达明显低于对照组(P0.01),与皮肤损害程度有关(rs=-0.446,P0.01);MGMT基因启动子区甲基化患者MGMT蛋白表达明显低于非甲基化组(P0.05)。砷中毒组皮肤组织中DNMT1蛋白表达强于对照组(P0.01),并与皮肤损害程度有关(rs=0.740,P0.01);且MGMT基因启动子区甲基化患者组织中DNMT1蛋白表达明显高于非甲基化组(P0.05)。结论 MGMT基因启动子区高甲基化抑制了燃煤污染型砷中毒患者皮肤组织中MGMT蛋白的表达,且DNMT1蛋白的高表达参与了此抑制过程。     

AP-1在锌离子诱导BEAS-2B细胞COX-2基因转录中作用

目的 探讨外源性锌离子对人支气管上皮细胞环氧化酶2(COX-2)基因诱导表达及转录因子激活蛋白-1 (AP-1)的转录活性调节作用.方法 以人支气管上皮细胞株BEAS-2B作为体外模型,Real-timePCR方法检测锌离子对BEAS-2B细胞COX-2基因表达影响;染色质免疫沉淀(ChIP)实验检测50.0 μmol/L锌离子温育8h后c-Jun(AP-1亚单位)和COX-2启动子的结合;用野生型和AP-1结合位点突变的COX-2启动子报告质粒转染BEAS-2B细胞,50.0μmol/L锌离子温育8h,采用荧光素酶报告基因检测COX-2基因启动子转录活性.结果 50.0μmol/L Zn2+组BEAS-2B细胞中COX-2的mRNA相对表达量为(1.23±0.16),是对照组表达量(0.16±0.02)的7.68倍,表达明显升高(P ＜0.5);AP-1可与COX-2的基因启动子结合,COX-2基因启动子区AP-1结合位点突变可使锌离子所致的COX-2高转录活性降低82％.结论 转录因子AP-1可调节外源性锌离子所致人支气管上皮细胞COX-2基因的转录表达.     

应用基因芯片技术筛选转染NOR1基因后HepG2细胞差异表达基因

目的研究转染NOR1基因后肝癌细胞系HepG2基因表达谱的改变。方法应用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1( )/NOR1真核表达载体和pcDNA3.1( )空白载体分别转染入肝癌细胞系HepG2,再分别提取转染pcD-NA3.1( )/NOR1和空载体pcDNA3.1( )的HepG2细胞总RNA,应用基因芯片技术进行芯片分析。结果芯片分析结果显示差异表达基因中上调的基因有59个,下调的基因有103个,这些差异基因的功能涉及多个方面。结论应用基因芯片技术成功筛选了NOR1基因转染细胞后差异表达基因,为阐明NOR1基因与肝癌发生发展的关系提供了实验依据。     

雌激素受体启动子异常甲基化作为白血病早期诊断分子标志物的实验研究

目的 探讨雌激素受体基因启动子区异常甲基化作为白血病早期诊断分子标志物的可能性.方法 应用MSP和RT-PCR检测40例急性白血病患者(未治疗)外周血雌激素(ER)受体启动子甲基化及其表达状态,Western-blot检测白血病细胞株以5'-Aza-Dc去甲基化前后蛋白表达的差异.结果 6种白血病细胞株以5'-Aza-Dc去甲基化后ERα蛋白表达明显增强,97.5%的急性白血病患者ERα-A启动子呈甲基化状态并导致其表达异常.结论 白血病细胞的雌激素受体基因启动子(ERα-A)存在异常甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标志物.