5-杂氮-2'-脱氧胞苷对HL-60细胞株Galectin-1基因的表达及甲基化影响

目的 探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对HL-60细胞Galectin-1基因表达的影响,并进一步分析药物处理后Galectin-1基因启动子区域甲基化状态的改变. 方法用5 μmol/L的5-aza-2dC处理HL-60细胞,采用Real-Time RT-PCR检测Galectin-1基因在药物处理与未处理组中的mRNA表达水平,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)榆测Galectin-1基因启动子区域在药物处理与未处理HL-60细胞中的甲基化水平.结果 Real-Time RT-PCR结果显示Galectin-1在处理后的HL-60细胞中表达上调,MSP结果显示,HL-60细胞Galectin-1基因启动子区存在高甲基化,经5-aza-2dC处理后能够使Galectin-1基因去甲基化.使其甲基化水平下降. 结论启动子区域高甲基化是Galectin-1基因低表达的原因之一,5-aza-2dC能够使Galectin-1基因去甲基化,逆转Galectin-1基因的表达,5-aza-2dC可能在抗急性髓系白血病中发挥重要作用.     

普鲁卡因酰胺诱导肝癌细胞启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达

目的　研究HepG2肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化与GSTP1基因表达的关系 ,并探讨普鲁卡因酰胺用于诱导因甲基化失活的GSTP1基因重新表达的可能性。方法　分别用 5 -杂氮 - 2′ -脱氧胞苷 (5 -Aza -CdR)和普鲁卡因酰胺处理HepG2细胞后培养 ,甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中GSTP1基因的甲基化状况 ,RT -PCR和Westernblot分别检测细胞中GSTP1mRNA和GST -π的表达。结果　HepG2细胞在去甲基化药物处理前 ,GSTP1基因完全甲基化 ,GSTP1基因不表达 ;药物处理后 ,普鲁卡因酰胺组和 5 -Aza -CdR组GSTP1基因有表达。结论　肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化可抑制GSTP1基因表达 ,普鲁卡因酰胺与 5 -Aza -CdR一样能使启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达     

5-氮-2'脱氧胞苷逆转人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因的表达

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne RIZ1基因启动子区甲基化状态及表达的影响,探讨人卵巢癌细胞系OVCAR3和AnglneRIZ1基因失活的机制及5-Aza-CdR对RIZ1基因表达的调控。方法:用5-Aza-CdR(浓度为5μmol/L)处理体外培养的人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne后,采用MSP法检测用药前后细胞中RIZl基因的甲基化状态,RT-PCR及Western-blot法检测用药前后细胞中RIZ1基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:在人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中,RIZ1基因启动子区呈异常甲基化状态,RIZ1基因mRNA及蛋白表达缺失,经过5-Aza-CdR处理后,RIZ1基因启动子区呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白重表达。结论:5-Aza-CdR可改变人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因甲基化状态,从而调控癌细胞中RIZ1基因的表达。     

5-氮杂胞苷对宫颈癌细胞FHIT基因去甲基化及抑制增殖作用

目的:探讨5-氮杂胞苷对Hela宫颈癌细胞脆性组氨酸三联基因(Fragile histidine triad gene,FHIT)启动子去甲基化作用及对其增殖的影响。方法:采用低浓度和高浓度5-氮杂胞苷作用Hela宫颈癌细胞,分别采用BSP和RT-PCR检测处理前后FHIT基因启动子甲基化状态和mRNA表达,应用MTT法检测细胞增殖改变。结果:Hela宫颈癌细胞FHIT基因启动子表现高度甲基化状态(CG位点甲基化率为80%～100%),mRNA表达完全受到抑制,细胞呈指数增殖状态;低浓度5-氮杂胞苷作用后的甲基化率显著降低(10%～40%),细胞增殖速度降低;高浓度组FHIT基因启动子甲基化状态被完全逆转,mRNA表达明显高于低浓度组,细胞增殖速度显著低于正常组和低浓度组。结论:5-氮杂胞苷可逆转Hela宫颈癌细胞FHIT基因甲基化状态,使基因恢复表达而抑制细胞增殖,去甲基化和抑制增殖作用随5-氮杂胞苷剂量增加而增加。     

错配修复基因启动子甲基化对食管癌发生的作用

目的探讨食管癌组织中错配修复基因1(hMLH1)启动子区甲基化状态及与食管癌发生、发展的关系。方法应用甲基化特异性PCR和免疫组织化学链霉菌抗亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S—P法)，检测92例人食管癌组织中hMLH1启动子甲基化状态及蛋白表达。结果92例食管癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化有30例，占32．6％。HMLH1基因启动子区甲基化与食管癌的临床病理无明显相关性；hMLH1基因蛋白表达阳性率为76．1％；hMLH1基因蛋白表达阴性的22例病例中，17例发生了甲基化(77．6％)；而70例hMLH1基因蛋白表达阳性者中，只有13例发生甲基化(18．6％)。结论食管癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化与hMLH1基因蛋白表达缺失密切相关，是导致其错配修复功能缺陷的重要原因之一，hMLH1基因启动子区甲基化可能在食管癌的发生和发展过程中发挥重要作用。     

甲基化抑制剂对肾癌细胞株中γ—caenin蛋白表达的影响

目的研究甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza—CdR）对人肾癌A498细胞增殖及^γ-连环蛋白（γ—catenin）表达的影响。方法使用不同浓度（10^-7、10^-6、10^-5mol／L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza—CdR处理A498肾癌细胞株。MTT检测5-Aza—CdR对。肾癌细胞株A498抑制作用。细胞免疫化学检测5-Aza—CdR处理A498肾癌细胞株后^γ—catenin表达的变化。结果5-Aza—CdR能明显抑制肾癌细胞的增殖,且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ-连环蛋白表达增加。结论γ-catenin蛋白表达受甲基化的抑制,提示5-Aza—CdR可使γ-catenin基因去甲基化而抑制A498肾癌细胞株增殖。     

纳米二氧化硅对HaCaT细胞中PAPR-1基因表达及其启动子甲基化的影响

目的 研究纳米二氧化硅(nm-SiO2)对人皮肤表皮细胞系(HaCaT)细胞中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 (poly[ADP-ribose] polymerase 1,PARP-1)基因的表达及其基因启动子区甲基化的影响.方法 分别以2.5、5.0、10.0 μg/ml的nm-SiO2溶液和10 μg/ml的微米级SiO2(micro-SiO2)溶液处理HaCaT细胞24 h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-CdR,DAC)处理48 h 10 μg/ml的HaCaT细胞为阳性对照(DAC组),并设立溶剂对照组(CTRL组).应用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹法(Western-blot法)检测PARP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化,应用亚硫酸氢盐测序(bisulfite pyrosequence,BSP)法检测PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化状态.结果 HaCaT细胞暴露nm-SiO2 24 h后,经nm-SiO2处理后,micro-SiO2染毒组和2.5μg/ml染毒组PARP-1表达与CTRL组的差异无统计学意义(P＞0.05),与CTRL组比较,5、10 μg/ml染毒组及DAC处理组细胞的PARP-1表达下调,差异有统计学意义(P＜0.05),且其下调水平随着浓度的增大而增高.BSP结果显示PARP-1启动子区-229点甲基化状态升高.结论 nm-SiO2可以降低HaCaT细胞中PARP-1基因的表达,可能与其对PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化影响有关.     

抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与卵巢癌的关系

目的:探讨抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与卵巢上皮性癌发生的关系。方法:以卵巢癌组织及卵巢癌细胞系为研究对象。MSP检测RIZ1基因甲基化状况;RT-PCR、蛋白印迹分别检测RIZ1mRNA及蛋白表达;细胞增殖实验检测5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理卵巢癌细胞前后细胞的增殖状况。结果:卵巢癌组织、卵巢癌细胞系、良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织中的甲基化率分别为25.8%、40%、0%和0%。5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理RIZ1基因发生甲基化的卵巢癌细胞系后,RIZ1基因重新获得表达;且去甲基化处理后,卵巢癌细胞生长均减慢。结论:抑癌基因RIZ1启动子区甲基化与上皮性卵巢癌的发生有关,DNA甲基化是其表达缺陷的原因之一。     

燃煤污染型砷中毒人群MGMT基因甲基化、转录及表达的研究

目的了解O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT基因)启动子区甲基化、转录及表达以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的转录及表达与砷中毒的关系。方法采集68例燃煤污染型砷中毒(以下简称砷中毒)患者(轻度24例、中度28例、重度16例)及23例非病区居民外周血。用甲基化特异性PCR法(MSP)检测MGMT基因启动子区甲基化,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测MGMT及DNMT1 mRNA的水平。利用自愿手术治疗的砷中毒患者皮肤组织标本(61例,其中34例为一般病变,21例为癌前病变,6例为癌变)和对照皮肤组织标本(15例),以免疫组织化学(IHC)法检测砷中毒患者及对照皮肤组织中MGMT及DNMT1蛋白的表达。结果 MGMT基因启动子区甲基化阳性率与砷中毒程度有关(χ2=13.739,P0.01)。砷中毒组MGMT mRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);MGMT基因启动子区甲基化患者和非甲基化患者之间MGMT mRNA和DNMT1 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。但轻、中度患者DNMT1 mRNA表达明显低于对照组(P0.01);癌前病变组和癌变组皮肤组织中MGMT蛋白表达明显低于对照组(P0.01),与皮肤损害程度有关(rs=-0.446,P0.01);MGMT基因启动子区甲基化患者MGMT蛋白表达明显低于非甲基化组(P0.05)。砷中毒组皮肤组织中DNMT1蛋白表达强于对照组(P0.01),并与皮肤损害程度有关(rs=0.740,P0.01);且MGMT基因启动子区甲基化患者组织中DNMT1蛋白表达明显高于非甲基化组(P0.05)。结论 MGMT基因启动子区高甲基化抑制了燃煤污染型砷中毒患者皮肤组织中MGMT蛋白的表达,且DNMT1蛋白的高表达参与了此抑制过程。     

RASSF1A基因在膀胱移行细胞癌中转录表达和启动子甲基化的研究

目的探讨RAssF1A（RAS association domain family1A）基因mRNA表达水平和基因启动子区CPG岛甲基化的关系。方法：用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术鉴测37例膀胱移行细胞癌（bladdert tansitional cell Carcinoma,BTCC）组织和8例正常膀胱组织中RASSFIA基因mRNA表达水平;用甲基化特异性PCR（Methylation—Specific PCR,MSP）。方法研究膀胱移行细胞癌组织和正常膀胱组织中的RASSF1A基因启动子区CPG岛甲基化状态。结果RASSF1 AmRNA在8份正常膀胱组织中全部表达,在BTCC组织中的表达率为35．1％（13／37）,二组间表达差异有显著性（P〈0．05）,但在各肿瘤分期、病理分级间的表达差异无显著性（P〉0．05）。在正常膀胱组织中RASSF1A基因启动子未发生甲基化,但在BTCC组织中RASSFIA基因启动子甲基化频率为51．3％（19／37）。二组间表达差异有显著性（P〈0．05）。在19份启动子异常甲基化的BTCC标本中,有16份同时伴有RASSF1AmRNA表达缺失．,两者存在明显相关性（P〈0．05）。结论RASSFIA基因启动子在BTCC组织中发生异常甲基化,使RASSF1AmRNA表达缺失或下调,从而使RASSF1A基因失活,参与了肿瘤的发生,而与肿瘤的进展可能无关。     

TFF1甲基化状态对食管鳞状细胞癌TE1和TE13细胞凋亡的影响

目的 观察食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）及其周围组织中三叶因子家族1（trefoil factor family, TFF1）的表达,分析TFF1的甲基化状态对细胞凋亡的影响。方法 收集43例ESCC患者和36名健康对照个体的食管组织标本,利用免疫组化染色观察TFF1在正常食管组织、ESCC及其周围组织中的表达情况;采用MSP法检测TE1和TE13细胞中TFF1启动子甲基化状态,qRT - PCR法检测TE1和TE13细胞去甲基化前后TFF1 mRNA表达水平,western blot检测TE1和TE13细胞去甲基化前后TFF1和caspase - 3蛋白的表达。结果 （1）在肺腺癌阳性对照和正常食管腺上皮组织中,TFF1呈阳性表达,而在ESCC或肿瘤周围组织中未观察到着色。（2）处理前,TE1和TE13细胞TFF1呈高甲基化状态;处理后,两组细胞TFF1甲基化程度明显降低,且TE13低于TE1。（3）未处理前,TE1和TE13细胞TFF1 mRNA表达水平较低,处理后,两组细胞中TFF1 mRNA的表达水平明显升高,且TE13高于TE1（P＜0.001）。（4）经西他滨处理后,两组细胞TFF1蛋白和激活型caspase - 3蛋白表达明显升高（P＜0.01）。结论 （1）TFF1在ESCC及其周围组织中的表达缺失,与TFF1高甲基化状态有关;（2）TFF1甲基化下调后,TE1和TE13细胞中TFF1 mRNA和TFF1蛋白的表达均增加,通过激活caspase凋亡通路,促使细胞凋亡增加,在ESCC中起着肿瘤抑制剂的作用;（3）TFF1可作为ESCC早期诊断的生物标志物和临床治疗的潜在靶目标。     

PTEN异常表达及甲基化与膀胱移行细胞癌的关系

目的:探讨PTEN基因mRNA异常表达及其启动子甲基化与膀胱移行细胞癌的关系。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测膀胱移行细胞癌组织48例和正常对照15例PTEN基因mRNA的表达水平和应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子的甲基化。结果:PTEN基因mRNA在膀胱癌患者的表达在48例中有27例,而正常对照全部有表达;正常对照全部未检测到PTEN基因启动子甲基化,而膀胱癌患者启动子甲基化有23例。结论:PTEN基因mRNA表达缺失可能与启动子甲基化有关,在膀胱移行细胞癌的发生、发展及转移过程中起重要作用。     

氟化钠对人成骨细胞CyclinD1基因启动子区甲基化及其转录表达的影响

目的构建人原代成骨细胞氟中毒模型,检测不同剂量氟化钠对人成骨细胞中CyclinD1基因启动子区甲基化、mRNA转录及蛋白表达的影响,从细胞周期调控基因的表观遗传学角度探索氟中毒发生机制。方法在知情同意原则下,收集贵州航空工业集团贵阳医院骨科外伤手术健康人(车祸)髂骨或股骨松质骨。采用酶消化法分离人原代成骨细胞,以碱性磷酸酶及钙化结节染色进行细胞鉴定;以0、125、250、500及1 000μmol/L氟化钠处理细胞72 h。以硫化测序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测CyclinD1基因启动子区甲基化状态;以实时荧光定量PCR(QT-PCR)检测CyclinD1基因转录mRNA相对表达量;以免疫印迹法(Western-blotting)检测CyclinD1蛋白表达。结果分别以0、125、250、500及1 000μmol/L氟化钠处理细胞72 h后,CyclinD1基因启动子区未检测到甲基化;CyclinD1基因mRNA转录相对表达量在0、125、250、500及1 000μmol/L Na F剂量组分别为0.414±0.093、0.742±0.089、0.796±0.122、1.114±0.260、1.140±0.171,NaF剂量组均高于对照组(F=18.89,P0.05)。CyclinD1蛋白相对表达量分别为0.304±0.014、0.395±0.020、0.511±0.042、0.565±0.028、0.719±0.047,NaF剂量组均高于对照组(F=71.80,P0.05)。CyclinD1基因转录mRNA及其蛋白表达随氟化钠剂量的升高均相应上升(P0.05)。结论氟化钠上调人成骨细胞中CyclinD1基因转录与表达,是氟致人成骨细胞增殖能力及细胞周期时相分布发生改变的重要分子机制之一,但未观察到CyclinD1基因启动子区甲基化参与其表达上调过程。     

5-氮杂脱氧胞苷对肿瘤细胞p16基因甲基化及表达的影响

[目的]探讨甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对肿瘤细胞p16基因的甲基化状态及其表达的影响.[方法]利用5-Aza-CdR（106 mol/L）处理肿瘤细胞株（SPC-Al、BIU-87、T-24、Hep-G2）9 d,甲基化特异性PCR法（MSP）检测了用5-Aza-CdR处理前后4株肿瘤细胞p16基因的甲基化状态,同时利用RT-PCR检测了5-Aza-CdR处理前后p16基因的表达水平差异.[结果]除BIU-87外,其他3种肿瘤细胞p16基因都有不同程度的甲基化,用5-Aza-CdR处理后比处理前p16 mRNA的表达有显著升高（P＜0.01）.[结论]p16基因的过甲基化是导致其表达失活的一个重要机制,而5-Aza-CdR可显著抑制肿瘤细胞p16基因的过甲基化.     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(HVSMCs)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养,在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy(0、30、100、200、500和1000μmol/L),并孵育72h,以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态,采用RT-PCR测定MTHFR mRNA的表达水平。结果不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后,其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化,甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化,并使MTHFR mRNA表达增加。     

SAH抑制内皮细胞增殖和ER-α表达作用

目的 探讨胞内S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-α(ER-α)表达变化的关系.方法 以永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,经不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)强效抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24,48,72 h.利用细胞计数法、流式细胞仪和脱氧核糖核酸转移酶缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞的增殖凋亡能力,蛋白印迹法检测ER-α蛋白的表达,荧光定量-PCR(qRT-PCR)检测其mRNA表达,甲基化特异PCR法(MSP)检测ER-α基因启动子甲基化状态.结果 经DZA处理后,HUVEC增殖能力降低(主要受阻于G1/G0期),细胞凋亡率增加(P<0.05),ER-α mRNA和蛋白的相对表达量降低(P<0.05),但其启动子甲基化不发生改变.结论 胞内SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-α的表达变化有关,但这种作用不是通过改变ER-α基因启动子的甲基化而实现.     

子宫内膜癌中PR基因表达缺陷及其启动子区CpG岛甲基化的研究

[目的]研究子宫内膜癌中孕激素受体亚型PRA、PRB表达与其启动子区甲基化状态的关系,探讨子宫内膜癌组织、细胞分子变化特征及孕激素受体亚型表达下调的机制。[方法](1)应用免疫组化SP法检测子宫内膜癌组织中PRA、PRB蛋白的表达。(2)应用甲基化特异性PCR检测子宫内膜癌组织及经5-杂氮脱氧胞苷(5′-aza-2′-deoxyóytidine ADC)处理前后子宫内膜癌Hec-1-B细胞系中PRA、PRB的甲基化状态。(3)应用免疫印迹法检测ADC处理Hec-1-B细胞系前后PRA、PRB蛋白的表达。[结果](1)与正常子宫内膜组织比较:PRA蛋白在高、中低分化子宫内膜癌组织中表达差异无统计学意义;PRB蛋白在高分化子宫内膜癌组织中表达无明显降低,差异无统计学意义,在中低分化子宫内膜癌组织中表达明显降低,差异有统计学意义。(2)与正常子宫内膜组织比较,子宫内膜癌组织中,PRA启动子区CpG岛甲基化率较低,差异无统计学意义,PRB启动子区CpG岛甲基化率较高,差异有统计学意义,与组织分化程度有关,与病理类型及有无淋巴结转移和有无肌层浸润无关;子宫内膜癌Hec-1-B细胞系中,加入ADC前PRA出现非甲基化条带,PRB出现甲基化条带,加入ADC后,PRA非甲基化条带不变,PRB甲基化条带消失。(3)子宫内膜癌Hec-1-B细胞系中加入不同浓度ADC后,PRA蛋白表达无明显改变,PRB蛋白表达不同程度增加。[结论]子宫内膜癌组织以及Hec-1-B细胞系中,存在PR基因异常甲基化,与PR表达下调关系密切,编码PR基因启动子的选择性B亚型甲基化,导致了PRB的失活,继而PRB蛋白表达下降或消失,可能参与了子宫内膜癌的形成。ADC可通过去甲基化作用使PRB恢复表达,可能提高子宫内膜癌的临床内分泌治疗效果。