71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的初步探讨浙江省结核分枝杆菌的数目可变串联重复序列（VNTR）的分型及分布特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株，常规培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）分别对VNTR位点进行检测分析，基因分型聚类分析采用BioNumerics软件。结果对71株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点进行检测。结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析，可分4个基因群（I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），58个基因型。分别为I群占8．5％，含5个基因型，Ⅱ群占18．3％，含13个基因型，Ⅲ群占70．4％，含38个基因型，Ⅳ群占2．8％，含2个基因型。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性，至少存在4个VNTR型，主要流行型为Ⅲ型。     

宁波市90株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的研究宁波市结核分枝杆菌的可变数目串联重复序列(VNTR)的分型及分布特征。方法随机选取宁波市结核分枝杆菌临床分离株,常规培养,提取菌体基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对15个VNTR位点进行检测,采用BioNumerics软件进行基因分型的聚类分析。结果 90株结核分枝杆菌临床分离株的VNTR位点检测结果显示出明显的基因多态性,基因分型经聚类分析,分为4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群),84个基因型。Ⅰ群占11.1%,含有10个基因型,Ⅱ群占17.8%,含15个基因型,Ⅲ群占65.6%,含54个基因型,Ⅳ群占5.6%,含5个基因型。结论宁波市结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显多态性得到初步证实,至少存在4个VNTR型,主要流行型为Ⅲ型。     

应用MLVA技术对吉林省294株结核分枝杆菌分型分析

目的初步探讨利用VNTR（variable number of tandem repeat）技术对吉林省294株结核分枝杆菌分型的分布特征。方法采用多位点串联重复序列（MLVA）分型方法初步选取13个分型效果较好的VNTR基因位点,采用聚合酶链反应（PCR）和琼脂糖凝胶电泳,通过BioNumerics（Versiort3．0）软件进行处理,分析吉林省耐药结核分枝杆菌的DNA多态性。结果共对294株结核分枝杆菌的13个VNTR位点进行了检测,根据这些菌株的指纹多态性特征,主要分成13个型,其中占据主要的前三型分别为I型,占81．6％（240／294）,二型占2．1％（6／294）,三型占1．7％（5／294）,由此可以看出本次实验菌株除I型以外,其他菌株基本呈散在分布。结论分析表明吉林省结核分枝杆菌以I型菌株为主,应加强此型菌株流行的监控及研究。     

江苏省结核分枝杆菌14个VNTRs位点的基因分型研究

目的了解江苏省结核分枝杆菌的VNTRs基因分型,发现江苏省流行的结核分枝杆菌的优势菌株,及不同地区流行菌株的基因型别差异。方法选择结核分枝杆菌基因组中14个具有明显多态性特征的VNTRs位点,对江苏省13个市的235株结核分枝杆菌进行VNTR-PCR扩增,通过聚类分析对菌株进行VNTRs基因分型。结果235株结核分枝杆菌菌株共分为8个基因型(Ⅰ～Ⅷ),其中以Ⅱ型为主要的基因型,占49.4%,其次是Ⅰ和Ⅴ型,分别占总数的22.6%和18.7%。不同地区结核分支杆菌VNTRs基因型别分布有统计学意义(P<0.001),其中V型主要分布在苏北(占90.9%),而Ⅰ型在苏南的分布明显高于苏北。结论江苏省的结核分枝杆菌具有明显的VNTRs多态性,Ⅱ型为江苏全省流行的优势菌株,约占全部菌株的1/2,但不同地区流行菌株的基因型别存在明显差异。     

聚合酶链反应扩增指纹多态性快速分型技术在部队结核病分子流行病学研究中的应用

目的 探讨南方部队结核病的分子流行病学规律。方法 设计一对特异性IS6110外向性引物，应用聚合酶链反应(PCR)建立检测结核分支杆菌DNA指纹多态性的方法，分析结核分支杆菌DNA多态性与流行病学的关系。结果 共检测分析了154株结核分支杆菌DNA的指纹多态性。根据这些菌株的指纹多态性特征共分为8个类型，以Ⅰ型(36．4％)、Ⅱ型(31．8％)和Ⅲ型(21．4％)为主，其余各型均少于4％。以20—29岁和30—39岁组在这三型中所占比例最大，分别为31．8％和27．9％。驻城镇部队与驻乡村部队以及结核病患者有无卡介苗接种史，在这三型的分布差异无显著统计学意义(P＞0．05)。但初治与复治患者分离菌株的PCR扩增指纹类型的分布差异有显著统计学意义(P＜0．05)。所检测菌株是否具有耐药性，在这三型中的分布差异也有显著统计学意义(P＜0．05)。菌株耐药主要为单耐异烟肼和利福平，耐药菌株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中所占比例分别是44．4％、29．6％和14．8％。结论 PCR扩增指纹多态性分型技术是一种简便、快速、敏感、特异和重复性好的分型方法，可用于结核病的分子流行病学研究。南方部队结核分支杆菌的传播以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型为主，应加强此三型菌株流行的监控。     

天津地区临床分离结核分枝杆菌分型的初步研究

目的探讨天津地区结核分枝杆菌临床分离株分子流行病学特征。方法连续收集天津市海河医院2005年8月16日11月25日就诊患者痰培养阳性的结核分枝杆菌100株，采用间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）和多位点可变串联重复序列（VNTR）两种方法进行基因分型，并运用软件对二者的结果进行分析。依据北京分化支的定义，运用多重和实时定量PCR方法将其区分为W菌／典型北京家族菌株和非典型北京菌株，Χ^2检验分析两种亚群与患者年龄和耐药性之间的联系。结果排除污染菌株，共对96株结核分枝杆菌临床分离株进行两种方法的基因分型，spoligotyping结果91．7％为北京基因型（含3株类北京基因型）结核分枝杆菌（88／96）。VNTR分型可将北京基因型分为60种基因型。在北京分化支结核分枝杆菌中，W菌／典型北京家族菌株占93．2％（82／88）。两种北京分化支亚群与患者年龄及耐药性之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论天津地区结核病患者临床分离的结核分枝杆菌中，北京基因型呈现较为明显的优势。VNTR的分辨率明显高于spoligotyping。北京分化支的两种亚群在天津地区临床结核病患者中均有流行，但以W菌／典型北京家族菌株为主。     

344株结核分枝杆菌的基因分型研究

目的研究间隔区寡核苷酸序列基因分型技术、结核分枝杆菌散在分布重复单位(MIRU),以及多位点串联重复序列(VNTR)在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省局部地区MIRU-VNTR基因型种类与分布,以及北京家族基因型在河南省的分布特征。方法应用2007年在河南省的嵩县、新密县、扶沟县、中牟县等4个县及南阳市的结核病防治机构实验室分离培养的344株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术及间隔区寡核苷酸分型技术对结核分枝杆菌进行VNTR分型检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics软件。结果对344株结核分枝杆菌临床分离株的间隔区寡核苷酸分型结果显示,有299株为北京家族基因型,占86.9%;12个MIRU位点检测结果显示明显的基因多态性;经基因聚类分析,可分5个基因群(Ⅰ~Ⅴ群),292个基因型,Ⅰ~Ⅴ群分别占5.1%、67.8%、21.9%、1.4%、2.8%。结论河南省结核分枝杆菌MIRUs基因存在明显的多态性,存在≥5个MIRU型,主要流行型为Ⅱ型;北京家族基因型占主导地位,北京家族基因型与耐药无明显相关性。     

仙居县80株结核分枝杆菌临床分离株VNTR基因分型研究

目的了解仙居县结核分枝杆菌临床分离株不同基因型的分布情况,探讨该县结核病分子流行病学特征。方法收集2011年4月-2012年3月仙居县分离的80株结核分枝杆菌,采用15位点VNTR方法进行基因分型,用Bio Numerics 5.0软件对结果进行聚类分析。结果 15个VNTR位点中,MIRU26和Mtub21(HGI=0.827)多态性较高,ETRC(HGI=0.165)和ETRB(HGI=0.292)多态性较差;15位点VNTR分型方法的HGI指数为0.998。经Bio Numberics5.0软件聚类分析,可将检测到的78个基因型分为8个基因群(Ⅰ群~Ⅷ群),各群所含基因型分别为Ⅰ群7个,占8.97%;Ⅱ群8个,占10.26%;Ⅲ群43个,占55.13%;Ⅳ群5个,占6.41%;Ⅴ群2个,占2.56%;Ⅵ群7个,占8.97%;Ⅶ群4个,占5.13%;Ⅷ群2个,占2.56%。结论仙居县流行的结核分枝杆菌VNTR基因存在明显多态性,至少有8个VNTR基因群,主要流行群为Ⅲ群。     

15个VNTR位点用于87株丽水市结核分枝杆菌分离株的基因分型研究

目的:选取2008年-2010年间丽水市结核分枝杆菌临床分离株,通过多位点可变数目串联重复序列分型,了解丽水市结核分枝杆菌流行菌株基因分型情况。方法:对临床分离株进行常规培养,收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)分别对15个VNTR位点进行检测分析,基因聚类分析采用BioN-umerics软件。结果:经聚类分析,87株结核分枝杆菌分为4个基因群(I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群)69个基因型。其中Ⅳ群占74.7%,含49个基因型,I群占9.2%,含8个基因型,Ⅱ群占8%,含7个基因型,Ⅲ群占5.75%。含5个基因型。结论:丽水市的结核分枝杆菌存在基因多态性,其主要流行型为Ⅳ型。     

应用Spoligotyping技术对吉林省结核分枝杆菌基因分型的研究

目的 使用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）对吉林省333株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型。方法收集吉林省内结核分枝杆菌临床分离株，应用Spoligotyping方法进行基因分型研究。基因聚类分析采用BioNumerics软件。结果共在吉林省内收集到333株结核分枝杆菌临床分离株，可分为2个基因群，即北京家族（Beijingfamily）或称北京基因型（Bering genotype），非北京家族（non—Beringfamily），分别占89．5％（298／333）和10．5％（35／333），29种基因型。其中22株为独特类型，余311株分为7簇。北京家族菌株中，95．0％（283／298）为典型北京家族，非北京家族菌株表现为高度的基因多态性，可分为19个基因型，16株为独特的基因型。结论吉林省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。     

45个可变数目串联重复序列位点用于中国结核分枝杆菌基因型鉴定的分辨力评价

目的 评价结核分枝杆菌基因组中串联重复序列(VNTR)位点在中国结核分枝杆菌临床分离株的分型鉴定的分辨力.方法 参考http://minisatellites.u_psud.fr/网站记载的位点选取其中VNTR位点,参照H37Rv结核分枝杆菌标准株全基因序列,利用DNAStar软件设计引物,采用PCR分别对中国结核分枝杆菌临床分离株和H37Rv标准株的VNTR位点进行检测,根据PCR凝胶电泳图片中各菌株相应位点扩增产物的大小,确定重复单元的重复次数.计算Hunter-Gaston指数来分析各位点的分辨能力,及各位点合并分辨力.结果 共检测135株中国结核分枝杆菌临床分离株和H37Rv标准株的45个VNTR位点.结果显示45个VNTR位点对136株菌的分辨力各不相同,Hunter-Gaston指数最大者为0.814(0.797～0.830),最小者为0.015(0.001～0.028),＞0.5的有13个位点.位点的合并分辨力分析显示,随着位点数量增加,分辨力增强,如Qub11-b和Qub18两个位点合并分析,Hunter-Gaston指数为0.936,分组数为44组;Qub11-b、Qub18、Mtub21、Rv2372、MIRU26、Qub26、Qub4156c、Qub11-a和Qub15等9个位点合并分析,Hunter-Gaston指数已经达到1,组数为136组,表示已达到最大分辨力,即株水平分型.结论 不同VNTR位点具有不同的分辨力.其分型分辨力,多位点联合明显好于单位点.Qub11-b等9个位点的合并分型能力较好,这些位点有利于结核分枝杆菌的分型研究.     

结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分型方法标准化操作程序的建立

目的 建立结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的标准化方法,评价该方法的分型能力、应用价值.方法 选取15个位点,采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对中国54株结核分枝杆菌临床分离株进行分型.结果确定标准化的MLVA方法,包括细菌分离培养、核酸提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳等实验步骤及标化参数的相关数据分析软件的使用.VNTR位点确定为ETRA、ETRB、ETRC、ETRD、ETRE、MIRU10、MIRU16、MIRU23、MIRU26、MIRU27、MIRU39、MIRU40、Mtub21、Mtub30和Mtub39.结论建立MLVA标准化技术方案,该方法操作简便,分型鉴定能力及实验室间结果可比性强,便于网络化,有利于结核病流行中追溯传染源,分析流行趋势.     

24-locus MIRU-VNTR and Spoligotyping analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated from Northeastern Thailand

Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB) infection, remains a global health problem with increased concerns due to drug-resistant tuberculosis. However, molecular genotyping profiles may give insight of the transmission of TB in a particular region. The present study aimed to characterize the genetic diversity of drug-resistant MTB and evaluate primer sets applied for the epidemiological study of circulating MTB in Northeastern Thailand. A total of 92 MTB isolates, resistant to rifampicin and/or isoniazid, were collected from the Office of Disease Prevention and Control between 2013 and 2016. All isolates were genotyped by 24-locus MIRU-VNTR typing combined with spoligotyping. We also analyzed the distributions of drug susceptibility pattern and demographic data among different genotypes. In comparison with different loci sets, discriminatory power based on 12, 15, 24 standard primers were investigated. Eighty-six particular profiles were found; among the patterns, two clusters were produced in 8 strains. East African Indians (EAI) were the most prevalent strains (33 isolates, 35.87%) followed by Beijing (30 isolates, 32.61%), with 23 unknown isolates strains also found. The HGDI based on combination of 24 loci analysis and spoligotyping was 0.9962. The number of tandem repeat generated was highly discriminant (HGDI>0.6) at locus 580 (0.66), 960 (0.67), 2163b (0.73), 2165 (0.62), 2461 (0.68) 3690 (0.73) and 4052 (0.79), respectively. In contrast, the diversity at locus 154 and 2059 was not revealed. The results emphasized that 24-locus MIRU-VNTR and spoligotyping could be useful for epidemiological surveillance of drug-resistant MTB in this region. At a given allelic diversity, 7 primer sets containing MIRU04, MIRU10, QUB2163b, ETRA, ETRB, Mtub39 and QUB26 may be considered for screening the VNTR patterns. In addition, this study gathered both demographics and genotypic data within the same investigation for further tuberculosis prevention and control.     

四川省结核分枝杆菌VNTR分型研究

目的评价不同串联重复序列(VNTR)位点在四川省结核分枝杆菌中的基因多态性,以及不同VNTR位点组合在四川省结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法采用多位点数目可变串联重复序列分析技术(ML-VA)对102株四川省结核分枝杆菌菌株的15个VNTR位点进行分析,基因多态性分析采用Hunter-Gaston指数,聚类分析采用BioNumerics软件。结果 15个VNTR位点的基因多态性存在较大的差异,位点Mtub21(HGI 0.772)和MIRU26(HGI 0.764)的多态性较高,ETR-C(HGI 0.168)和MIRU23(HGI 0.077)的多态性较差。ETR-B和ETR-C两个位点在对四川省北京基因型结核分枝杆菌进行分型时则不具有多态性。对不同的VNTR位点组合进行比较,随着VNTR位点的增加,VNTR分型方法的分辨能力也有所提高。10个VNTR位点组合的分辨指数与15位点组合的分辨指数相差不大。同一VNTR位点在不同地区北京基因型菌株中的分辨力也存在较大的差异。结论不同VNTR位点在四川省结核分枝杆菌中具有不同的分辨力,并且同一VNTR位点在不同地区的北京家族菌株中的分辨力也不同。10个VNTR位点组合的基因分型方案可用于四川省结核分枝杆菌基因分型的一线方法。本研究的数据结果对挑选适合中国结核分枝杆菌基因分型的VNTR位点组合法具有重要的作用。     

多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的初步探讨多位点数目可变串联重复序列(MLVA)技术在西藏地区结核分枝杆菌基因分型中的应用和初步了解西藏地区结核分枝杆菌数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法在拉萨、山南、林芝、日喀则、那曲、昌都6个地区结核病防治中心收集结核分枝杆菌临床分离菌株,设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌20个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果共收集到217株结核分枝杆菌,分为19个不同的VNTR基因型,其中以Ⅺ型为主要基因型占87.6%(属于北京家族),其次Ⅵ型、ⅩⅤ型、ⅩⅥ型各占1.38%,Ⅰ型、Ⅶ型、ⅩⅢ型各占0.92%,12株结核分枝杆菌为单一的基因型。不同地区之间,以Ⅺ型为主要基因型,分别占各地区的86.8%、91.3%、78.95%、88.2%、95.05、89.3%。结论西藏地区的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为VNTRⅪ型(即北京家族基因型),初步研究结果显示北京家族基因型与卡介苗接种和耐药性无相关性。MLVA分型方法简单、快速,可以有效地用于结核分枝杆菌的基因分型和病原监测。     

Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics.

The recent introduction of molecular methods has gained increased acceptance as a powerful tool for epidemiology and phylogeny of tuberculosis (TB). In this investigation, the efficiency of molecular typing using mycobacterial interspersed repetitive units (MIRUs) was assessed on a set of 116 Mycobacterium tuberculosis complex clinical isolates from 11 different geographic origins. The results obtained were compared with spoligotyping and variable number of tandem DNA repeats (VNTRs) typing data. Eighty-nine different MIRU profiles were obtained on the sample studied. Spoligotyping- or VNTR-defined clusters were split into subclusters by MIRU typing. Conversely, almost all of the clinical isolates clustered by MIRUs were shown to belong to spoligotyping-based defined clusters. The calculation of the discriminative power by the Hunter-Gaston index (HGI) for VNTR, spoligotyping and MIRU typing gave the values of, respectively, 0.959, 0.965 and 0.988, showing the high discriminative power of the MIRUs. The allelic diversity of the sample was calculated for each of the MIRU-VNTR loci; five MIRU loci (MIRU nos. 10, 23, 26, 31 and 40) were "highly discriminant", four (MIRU nos. 4, 16, 24 and 39) were "moderately discriminant", and three (MIRU nos. 2, 20 and 27) were "poorly discriminant". Among the three complementary VNTRs (exact tandem repeats ETR-A, ETR-B and ETR-C), ETR-A was the most discriminant locus. A combined numerical analysis of spoligotyping, VNTR and MIRU typing results partly corroborated a recently hypothesized evolutionary scenario for the M. tuberculosis complex. M. canettii would be the first branch to have diverged from a common M. tuberculosis complex ancestor. The East-African Indian (EAI) clade could be the first family to have diverged thereafter. A third branching separated a M. africanum-M. bovis clade, followed by a node separating Beijing versus non-Beijing M. tuberculosis. The Beijing clade was distinct from the Central Asian 1 (CAS1) family. Among non-Beijing strains, branches such as the Latin-American and Mediterranean (LAM), X and Haarlem clades diverged later. In conclusion, the results obtained show the congruence between clades defined by spoligotyping, and MIRU-VNTR, and underline the potential of these methods for M. tuberculosis phylogeny reconstruction. We also conclude that MIRU typing is a very promising method that may be used in a "two PCR-based" genotyping strategy, in conjunction to conventional epidemiological investigations.     

武汉市耐多药结核分枝杆菌的MIRU-VNTR分子特征

目的 描述武汉市耐多药结核分枝杆菌基因型分布及成簇特征。方法 选取15个结核分枝杆菌重复序列（mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU）,对98株耐多药结核分枝杆菌进行多位点数目可变串联重复序列分析（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing,MIRU-VNTR）分型,计算差异遗传值、Hunter-Gaston指数（Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI）、成簇率以及近期感染率最小估计值。结果 MIRU位点组合的多态性差异遗传值为0.960 4、HGDI为0.970 8,多态性和分辨指数最高的位点为Mtub 21及MIRU 26。共产生7个基因簇和65个独立基因型,成簇率为33.67%,近期感染率最小估计为26.53%。结论 15位点MIRU-VNTR分型法分辨指数较高,适合于武汉地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型。尽管武汉市耐多药肺结核病的流行多半归因于内源性复燃,但仍有较高比例的近期传播。     

上海市2000-2002年91株结核分枝杆菌分子流行病学分析

目的探讨上海地区结核病分子流行病学特点。方法对从上海市疾病预防控制中心菌株库中随机抽取的2000—2002年各50株耐药和敏感菌株进行间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）和分枝杆菌散在分布重复单位（MIRU）基因型分型，并结合流行病学资料进行分析。结果抽样菌株中，具有特异Spoligotyping指纹图谱的北京基因型菌株在上海地区分布达89％（81／91）。未接种过卡介苗（BCG）的患者中北京基因型菌株占88．5％（54／61），接种过BCG的患者中北京基因型菌株占90％（27／30），差异无统计学意义。北京基因型菌株耐药率为45．7％（37181），低于非北京基因型菌株的耐药率60．0％（6／10），差异无统计学意义。MIRU成簇菌株占所有菌株的62．6％（57／91）。结论北京基因型菌株在上海地区有广泛分布，北京基因型菌株与BCG接种和耐药无关，结核病患者中有部分是由于近期传播而引起的。     

结核分枝杆菌传播的分子流行病学特征

目的探讨结核分枝杆菌传播的基因型特征及其对于耐药结核菌近期传播的影响。方法选取13个社区作为监测点,应用分枝杆菌散在重复单位(MIRU)技术分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果 558株结核分枝杆菌的12个MIRU位点检测产生143个基因型,其中成簇基因型66个,成簇率86.2%;74.6%的菌株属于北京家族,177个菌株(31.7%)属于山东基因型;耐多药菌株的近期感染估计值(46.7%)明显低于全敏感菌株(72.7%)。结论山东基因型菌株具有较强的在人群中传播的能力、较高的耐药性以及对抗督导化疗的能力;利用基因分型技术开展结核病监测可以有效促进结核病控制工作。