多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的比较肺炎链球菌多重耐药株与敏感株标准参考菌之间的差异基因。方法使用抑制性消减杂交技术构建多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库,经斑点杂交筛选阳性克隆后对部分DNA片段进行测序和同源分析。结果成功的构建了肺炎链球菌多重耐药株差异DNA消减文库,经斑点杂交的初步筛选,有17个仅能与多重耐药株DNA探针杂交,而不能与敏感株DNA探针杂交。对这17个克隆片段测序及基因库检索分析,发现2个未知新序列。结论从全基因角度研究肺炎链球菌多耐药菌株与标准菌株基因组DNA分子遗传差异,为发现、克隆肺炎链球菌多重耐药相关基因提供依据。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

Lin-CD34-与Lin-CD34+细胞差异表达基因的鉴定

目的 克隆并鉴定Lin^-CD34^-细胞区别于Lin^-CD34^ 细胞的可能与其性状相关的基因。方法 以uLin^-CD34^-细胞作为检测对象，Lin^-CD34 细胞作为驱动细胞，应用抑制消减杂交技术构建Lin^-CD34^-细胞的cDNA消减库。选取部分克隆测序，测序结果与GenBank进行同源性比较和功能分析。结果 共获得593个含有插入片段的克隆，片段的长度为300～500bp。随机选取53条EST进行测序，其中37条EST代表了10个已知基因，其余16条EST。代表了4个未知序列。结论 利用抑制消减杂交技术鉴定出部分Lin^-CD34^-细胞特异表达的基因，可能与Lin^-CD34^-细胞的特性相关。     

胎兔皮肤创伤消减文库构建与瘢痕愈合基因的初步筛选

目的：许多哺乳动物的胎儿在妊娠期前2/3内皮肤创伤为无瘢痕愈合，其发生机制至今尚不完全清楚。应用抑制性消减杂交获得差异表达的片段并构建消减文库，为差异基因的筛选及可能出现的未知基因的功能研究提供前期铺垫。方法：选择孕20d的胎兔及孕兔分别在腰部做全层皮肤切口，12h后取材作为胎兔创伤（fetal trauma，FT）、胎兔对照（fetal control，FC）和成兔创伤（adult trauma，AT）。提取总RNA，合成dscDNA，经Rsa I酶切、Adaptor连接，两次杂交及两次抑制性PCR可获得差异性表达的片段。将扩增产物插入T载体并转染工程菌，培养后挑选阳性克隆。结果：经逐步验证获得61个较为可靠的阳性克隆。结论：设计并应用改良的SSH(2Drivers）替代传统的SSH，经实验证实在理论及实际操作上均可行且合理。消减文库的构建对无瘢痕愈合相关基因及其功能的后续研究提供了可靠的材料。     

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞中差异表达的基因，以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”，以源自意外而致流产的孕4—5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”，建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选，并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明：在所构建的AGM抑制消减杂交文库中，经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200—700bp的克隆有211个，阳性率高达76.4％。经过基因芯片筛选，挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示，在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中，4个为未知基因，14个为已知基因，其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论 筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了重要的理论基础。     

内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的：建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库。方法：提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6h后mRNAs，反转录合成cDNA，与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因，亚克隆入T／A质粒并转化感受态大肠杆菌。结果：成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库，为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础。结论：经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因，对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断,肝肾功能正常,无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒,构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量;基因组DNARsaI酶切产物;消减杂交产物扩增结果;蓝白斑筛选阳性克隆;聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果:用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段,基因组DNA经过RasI酶切消化后,所得DNA片段主要集中在200～2000bp;消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后,产物明显增多,内含数条隐约可见的条带,主要集中在0.2～1.5kb;蓝白斑α互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆,结果正向消减杂交产物得到286个克隆,反向消减杂交产物得到262个克隆;随机挑取92个阳性克隆,经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段,大小为200～1000bp,从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的：运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法：选择2004—08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例．符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断，肝肾功能正常，无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U／A载体连接，经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒，构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量；基因组DNARsaⅠ酶切产物；消减杂交产物扩增结果；蓝白斑筛选阳性克隆；聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果：用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段．基因组DNA经过RasⅠ酶切消化后．所得DNA片段主要集中在200～2000bp；消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后，产物明显增多，内含数条隐约可见的条带．主要集中在0．2～1．5kb；蓝白斑q互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆，结果正向消减杂交产物得到286个克隆．反向消减杂交产物得到262个克隆；随机挑取92个阳性克隆，经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段，大小为200～1000bp，从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选白血病多药耐药相关基因

目的 克隆和筛选白血病多药耐药（MDR）相关基因。方法 以MDR白血病细胞株K562/DOX为检测样本。以K562细胞株为驱赶样本（对照）。应用抑制性消减杂交（SSH）技术分离和克隆K562/DOX细胞中过高表达的基因。构建cDNA消减库；通过反向Northern斑点杂交法进一步筛选消减库，对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；并采用RT-PCR和Northern blot方法对某些阳性克隆进行进一步的验证。结果 发现了11个在K562/DOX细胞中高表达的基因。包括S3核糖体蛋白（S3ribosomal protein,S3rp)基因，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位2（NADHdehydrogenase subunit2,ND2）基因，My023基因等，其中多数基因与肿瘤MDR的关系尚未见报道。结论 筛选到几个可能与白血病MDR形成有关的基因。提示了白血病MDR发生的新机制。     

急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库的构建与鉴定

研究目的是构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库，以用于白血病多药耐药(MDR)相关基因的筛选。采用改良的消减杂交方法建立急性白血病耐药细胞差异表达基因cDNA文库，提取HL-60／VCR与HL-60细胞mRNA，将HL-60／VCR细胞mRNA用Cap-Finder法反转录成cDNA，与以常规反转录的HL-60细胞cDNA为模板．PCR合成生物素标记的扣除探针进行杂交。杂交产物用Sephacryl S-400柱和具有链亲和素作用的磁殊纯化后，得到差异表达cDNA。PCR法特异扩增，进行T-A克隆建成消减cDNA文库，并通过反向点杂交鉴定其质量。结果表明：构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库所需样本量少且时间短，全长或近全长的cDNA分子较多(约达总数的2／3)，质量较高。结论：成功构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库，为筛选白血病耐药相关基因奠定了基础。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。