电压门控性钠离子通道β1 亚基条件性过表达转基因小鼠的制备

目的制备电压门控性钠离子通道β1亚基基因（SCN1b）条件性过表达转基因小鼠。方法将电压门控性钠离子通道p,亚基的编码序列片段插入表达载体pCMV—loxp—lacZ-stop—loxp—IRES—eGFP中;应用显微注射法将构建好的目的载体注入供卵小鼠受精卵核中,移植受精卵入假孕雌鼠输卵管;经PCR检测阳性的后代小鼠即为原代小鼠,通过后代小鼠X—gal染色鉴定目的基因在原代小鼠的整合部位。结果共获得13只仔鼠,其中3只为目的基因表达阳性的原代小鼠,其中1只原代小鼠的背根神经节（DRG）细胞X-gal染色呈阳性。结论成功制备在DRG条件性过表达SCN1b的转基因小鼠模型,为深入研究电压门控性钠离子通道β1亚基在痛觉调控中的功能提供了工具鼠。     

检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立

目的建立用于检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠.方法采用显微注射方法,将携带lacZ和人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)报告基因的ZAP载体导入近交C57BL/6小鼠554枚受精卵;利用PCR,Southern blotting技术对其仔鼠进行基因整合鉴定;应用X-gal染色方法,对转基因小鼠胚胎进行转基因表达检测.结果存活的398枚受精卵被移入21只假孕受体小鼠输卵管;13只受体怀孕产下68只后代.合子存活率和出生率分别为71%(398/554)和17%(68/398).在68只小鼠中,5只雄性和4只雌性小鼠整合有双报告基因.转基因整合率和有效率分别为13%(9/68)和1.6%(9/554).9只首建鼠与正常C57 BL/6小鼠杂交产生F1代小鼠.F1代小鼠转基因的传递符合孟德尔规律,X-gal染色仅在3只首建鼠的13.5 d龄胚胎中观察到.结论检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠已建立.     

人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.     

APP/PS1+SCN2B-/-转基因小鼠模型的建立及鉴定

目的建立APP/PS1+SCN2B-/-转基因小鼠,为深入研究SCN2B基因在AD发生发展中的作用提供实验工具。方法将APP/PS1转基因小鼠与SCN2B-/-转基因小鼠合笼,子代同胞兄妹交配,子代的后代中选取APP/PS1高表达和SCN2B阴性的小鼠再同胞兄妹交配,并培育。得到的目的基因的小鼠与WT小鼠对照,进行表型鉴定。运用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用RT-PCR验证Aβ和SCN2B在大脑中的蛋白的表达,通过免疫荧光观察SCN2B在转基因小鼠神经系统中的表达,最后用水迷宫在行为学上对转基因鼠进行鉴定。结果经PCR鉴定成功构建APP/PS1+SCN2B-/-转基因鼠杂交群体,并扩群培育,经免疫染色和RT-PCR分析转基因小鼠的Aβ和SCN2B在大脑中的蛋白的表达,发现Aβ在转基因鼠的海马和皮质中高表达,SCN2B在海马中几乎检测不到,免疫染色也未发现SCN2B在神经系统中的表达。水迷宫结果显示转基因鼠与同月龄野生型(WT)小鼠相比在空间记忆和认知差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建APP/PS1+SCN2B-/-转基因小鼠模型,从基因型、组织学表现到行为... 更多     

心肌特异性表达人KCNE4转基因小鼠模型的建立

目的本研究旨在建立心肌特异性表达人KCNE4（hKcNE4）基因小鼠模型，为探索hKCNE4基因对特定类型心房颤动的防治作用奠定基础。方法通过RT—PCR克隆hKCNE4基因，使用核酸内切酶和连接酶构建hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4α—MHC-Clone26，经过酶切鉴定、序列分析证实无误后用BamHI酶切获得转基因表达元件hKCNE4-α—MHC-hGHpA。将hKCNE4-α—MHC-hGHpA显微注入小鼠受精卵雄性原核，并将有活力的受精卵移植到代孕小鼠的输卵管。PCR鉴定出代孕鼠所生小鼠中转基因阳性原代（G0）小鼠，运用RT—PCR-测序技术对阳性G0小鼠与野生型小鼠交配所生的一代（G1）小鼠进行检测以识别出表达转基因的阳性小鼠。结果成功克隆了hKCNE4基因，正确构建了hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4-α—MHC-Clone26。代孕鼠共生产86只仔鼠，9只转基因阳性，2只（分别称其为LineA和LineB）转基因在心脏中高表达。对LineA和LineB的阳性后代进行初步表型分析发现其生长发育良好，繁殖力正常，体表心电图无明显异常。结论成功建立心肌特异性表达hKCNFA转基因小鼠模型，为进一步研究hKCNFA基因对特定类型心房颤动的防治作用提供了一种工具。     

癫痫的分子遗传学研究进展

遗传因素是导致癫痫的重要原因,分子遗传学研究现已发现15个癫痫的致病基因.其中大部分编码离子通道,包括:电压门控性钾离子通道KCNQ2和KCNQ3,钠离子通道SCN1A、SCN2A和SCN1B,氯离子通道CLCN2,配体门控性离子通道CHRNA4、CHRNB2、GABRG2和GABRA1.非离子通道基因也能导致癫痫,这些基因包括G-蛋白偶联受体,MASS1/VLGR1、GM3合成酶和其他一些尚不知道蛋白质功能的基因,如LGI1、NHLRC1和EFHC1.癫痫的分子遗传学研究不仅使基因诊断成为可能,而且会带动新型药物和治疗方法的研究和发展.     

人β地中海贫血β~(41-42(-CTTT))转基因小鼠的构建

目的建立可表达人类βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠。方法采用Gateway技术,将人类βCD41-42(-CTTT)基因克隆到真核表达载体p RP.Des2d-EF1A中,重组质粒通过PCR技术和测序方法进行验证。采用显微注射法将线性化的重组质粒注射至FVB小鼠受精卵的雄性原核中,然后将受精卵植入假孕母鼠的子宫。采用PCR技术筛选出整合了外源基因的小鼠,实时荧光定量PCR验证βCD41-42(-CTTT)基因的表达。结果成功构建了真核表达载体p RP.Des2dEF1A-βCD41-42(-CTTT)。在出生的24只新生鼠中,共获得5只阳性转基因首建小鼠。结论建立了人βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠模型,为β地贫的基因治疗研究奠定了基础。     

SCN4B/β4在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的探讨电压门控钠离子通道β4亚基（SCN4B/β4）在鼻咽癌组织中的表达,并分析其临床意义。方法应用免疫组织化学ElivisionTM Plus法检测90例鼻咽癌病人鼻咽部活检标本和20份存档的石蜡包埋正常鼻咽黏膜组织（主要为鼻咽黏膜慢性炎）标本的SCN4B/β4表达情况,分析SCN4B/β4的阳性表达与鼻咽癌病人临床病理特征的关系。结果鼻咽癌病人SCN4B/β4蛋白表达率低于正常鼻咽黏膜组织病人（P < 0.01）;SCN4B/β4蛋白表达在不同T分期、N分期、M分期、临床分期差异有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）,T₁~T₂期、M₀期、Ⅰ~Ⅱ期SCN4B/β4蛋白高表达率高于T₃~T₄分期、M₁分期和Ⅲ~Ⅳ期,随N分期增加,SCN4B/β4蛋白高表达率下降;SCN4B/β4高表达5年生存率为85.2%,高于SCN4B/β4低表达的60.3%（P < 0.05）。结论鼻咽癌组织的SCN4B/β4蛋白高表达与淋巴结和远处转移呈负相关,SCN4B/β4高表达病人生存率较高。     

系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western Blot方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western Blot发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。     

MLPA技术检测热性惊厥患儿SCN1A基因

目的探讨热性惊厥的临床特点及其与电压门控性钠离子通道α1亚单位基因(SCN1A)的关联。方法收集34例热性惊厥患儿的临床资料及外周血并提取其DNA,采用多重连接依赖式探针扩增技术对热性惊厥患儿的SCN1A基因进行检测。结果 34例热性惊厥患儿中单纯性热性惊厥29例,复杂性热性惊厥5例,所有患儿均进行SCN1A基因检测,均未发现SCN1A基因外显子缺失或重复。结论 SCN1A基因外显子的缺失或重复可能不是热性惊厥的潜在病因。