骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究

目的:探索煅烧骨(calcined bone calcium,CBC)作骨组织工程支架材料的可行性。方法:将CBC分纤维粘连蛋白修饰组和单纯培养液修饰组,分别与骨髓基质成骨细胞(marrow stromal osteoblast,MSO)于体外联合培养,进行扫描电镜观察和碱性磷酸酶活性检测,了解细胞在材料中的粘附、生长、增殖、分泌及材料与细胞的相互作用情况。结果:经系统处理过的CBC具有类似原骨的三维结构。体外培养12h细胞已贴附于CBC支架,复合培养7d,分布在支架上的细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质和矿化结节。碱性磷酸酶测定7d组的活性显著高于12h组活性(P<0.01)。两组之间扫描电镜观察和碱性磷酸酶测定均未见明显差异(P>0.05)。结论:CBC生物相容性好,不需作修饰即能促进成骨细胞的粘附、增殖、分泌活动,是骨组织工程的理想支架材料。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景:国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的:观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法:SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论:骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

不同类型骨组织工程支架材料的比较研究

目的：探讨本实验室所用的3类材料作为骨组织工程支架材料的可行性，寻找骨组织工程的最佳支架材料。方法：采用生物力学检测仪观察材料的强度；利用扫描电镜观察材料的立体结构；取4周龄兔骨髓，体外分离培养骨髓基质细胞，并加入诱导液，使细胞向成骨细胞分化，将细胞与支架材料共培养1，3，5，7d，通过倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在材料表面粘附、伸展及生长情况；将细胞与支架材料复合，并植入裸鼠背部皮下，植入4，8周后取材，行组织学检查，观察新骨形成情况。结果：3类材料均具有细胞复合成骨能力，其中珊瑚、珊瑚转化多孔羟基磷灰石（CHA）具有较为良好的物理性状、多孔性、细胞粘附性，及细胞复合成骨能力，作为支架材料更为优越。结论：珊瑚和珊瑚转化多孔羟基磷灰石（CHA）是骨组织工程比较理想的支架材料，与细胞复合为骨的再造及骨缺损修复开辟了新途径。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

应用纳米晶胶原基骨体外构建组织工程骨

目的:应用组织工程技术,建立体外诱导人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养的人工骨模型,探求细胞与纳米晶胶原基骨结合的最佳模式。方法:实验于2005-09/2006-09在江苏大学医学技术学院中心实验室完成。①实验材料:纳米晶胶原基骨材料由清华大学材料系崔福斋等人研制。骨髓取自骨科取髂骨患者(男性,30岁,患者知情同意)。②实验干预:全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞并扩增,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化。取纳米晶胶原基骨材料经60Co照射灭菌,无水乙醇疏水化,三蒸水洗去乙醇等处理制备支架材料。细胞与支架材料复合培养。③实验分组:骨髓间充质干细胞培养至第3代后分为两组:复合材料后加成骨诱导剂组:骨髓间充质干细胞先与纳米晶胶原基骨复合培养3d后再加入成骨诱导剂;成骨细胞复合材料组:骨髓间充质干细胞在诱导成骨细胞后与纳米晶胶原基骨复合培养。④实验评估:记录第3代骨髓间充质干细胞生长曲线。将诱导后细胞分别进行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色。扫描电镜比较两组复合物经体外孵育2周后,细胞在其中生长情况。结果:①细胞生长情况:倒置显微镜下观察原代培养的骨髓细胞增殖迅速,基本都呈形态均一成纤维样细胞,10～12d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代。诱导培养后的细胞呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型。②体外复合后细胞生长及基质分泌情况:细胞可在纳米晶胶原基骨内表面良好贴壁,复合材料后加成骨诱导剂组,细胞贴附,但成骨细胞少见;成骨细胞复合材料组,细胞数量明显较前者多。复合培养8d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长。细胞之间广泛存在突起连接,局部有胶原分泌,且可见成骨细胞形成。结论:证实纳米晶胶原基骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖,经成骨诱导后的细胞较骨髓间充质干细胞更易与材料贴附、增殖。     

可注射性纳米材料与兔成骨细胞的生物相容性

目的:将可注射性纳米材料与兔成骨细胞复合构建可注射性组织工程骨,观察其体外实验的生物相容性.方法:取16周龄、体质量约1.5 kg的新西兰大耳白兔双股骨大转子部和胫骨干骺端骨髓4～5 mL,将传至第三代的骨髓基质干细胞以成骨条件培养基定向诱导培养,获取成骨细胞.将成骨细胞与可注射性纳米材料体外复合培养,用噻唑蓝法测定细胞活性,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,并行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察.结果:可注射纳米材料组的成骨细胞保持正常的分裂增殖速度.可注射纳米材料组ALP活性值为2.135±0.085,对照组为2.141±0.107,两者差异无统计学意义(P＞0.05).激光共聚焦显微镜及扫描电镜可见,成骨细胞在可注射性纳米材料上可良好地增殖、生长,细胞的活性未受到材料的影响.结论:可注射性纳米人工骨具有良好的细胞相容性,可作为可注射性骨组织工程载体材料.     

人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养与生物学特性

背景:胚胎骨来源成骨细胞因其低免疫原性和高增殖与成骨活性有可能成为适用于骨组织工程方法异体骨组织缺损修复的种子细胞.冻存复苏后的牛物学特点是台能进行进一步临床应用研究有待证实.目的:建立人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养、保存方法,观察骨膜来源成骨细胞生物学特点.设计、时间及地点:细胞形态学与生物学特性实验研究,于2005-04/2006-05在天津市口腔医院细胞与组织工程实验室完成.材料:细胞来源为5月龄自然流产胎儿,产妇及家属知情同意,无菌条件下取长骨骨膜组织.方法:采用组织块法对成骨细胞进行原代培养,传代培养细胞液氮冻存3～6个月后,选择不同代次细胞复苏培养.主要观察指标:通过形态学、超微结构,细胞增殖曲线,钙结节Von kossa法染色以及细胞内碱性磷酸酶定量检测与钙钴法染色确定其增殖与成骨活性.结果:组织块法培养骨膜来源成骨细胞第6天即可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性.苏木精-伊红染色密集融合的成骨细胞与细胞外基质显示转化为脊样骨组织结构排列.经统计学分析定量榆测成骨细胞碱性磷酸酶活性与细胞密度有线性正相关关系.液氮冷冻保存后复苏培养复层成骨细胞钙钴法碱性磷酸酶染色阳性率在45%以上,超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞.结论:胚胎骨骨膜来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性.深低温液氮冻存成骨细胞复苏后仍能连续传代增殖并具有良好的成骨代谢活性,能够体外借助细胞外基质形成骨样结构.     

纤维连接蛋白表面修饰后聚酯纤维韧带细胞相容性的变化

目的：观察纤维连接蛋白表面预处理增加新型聚酯纤维韧带（ligament advanced reinforcement system,LARS）的细胞相容性的作用. 方法：实验于2005-09/11在上海复旦大学放射医学研究所骨细胞实验室完成.①实验分组：采用纤维连接蛋白表面修饰LARS人工韧带材料,为蛋白处理组.LARS人工韧带材料不做任何处理,为未处理组.蛋白处理组和未处理组在培养后2,4,6,8,10,12 d测定成骨细胞数量、MTT法测定吸光度（A值）、测定碱性磷酸酶值（A值）.②实验评估：成骨细胞和与LARS人工韧带材料体外共培养.培养后3,7 d扫描电镜观察成骨细胞在两组材料上的形态.培养后7 d行碱性磷酸酶染色,观察细胞的形态及细胞和材料的细胞相容性情况. 结果：①成骨细胞的数量：细胞在接种到材料后即开始增殖,在1～3 d内增殖较缓慢,自第4天起细胞增殖迅速,蛋白处理组至第8天达到增殖高峰,未处理组至第10天才达到增殖高峰.蛋白处理组材料和未处理组材料上细胞增殖基本符合正常细胞增殖.蛋白处理组材料细胞对数增长期较未处理组细胞增殖期长,且最高峰值也高（P＜0.05）.②成骨细胞的增殖能力：培养后2,4,6,8,10,12 d细胞增殖能力迅速增加,两组细胞增殖能力到第6天达最高峰,以后逐渐降低,在每个时间段蛋白处理组材料上的细胞的增殖能力均高于未处理组,差异有显著性意义（P＜0.05）.③成骨细胞的功能：培养后2,4,6,8,10,12 d细胞碱性磷酸酶值随时间推移基本稳定,略有下降,两组间差异无显著性意义（P=0.46）.④扫描电镜下成骨细胞形态：培养后3 d,未处理组材料上细胞沿材料表面和纤维孔径之间生长,细胞形态尚不典型.蛋白处理组材料上细胞形态比较典型,具有伪足和触角结构,细胞表面具有大量毛刺样结构.培养后7 d,蛋白处理组材料和未处理组材料上细胞生长情况均较好,可见细胞大量汇合,沿纤维表面和纤维间隙之间生长,可见细胞在蛋白处理组材料上数量更多,汇合面积更大.⑤成骨细胞的碱性磷酸酶染色：成骨细胞与LARS人工韧带支架材料共培养后,培养后2 d起在材料的周边可见梭形和三角形的细胞游离出,进而贴壁汇合,数量逐渐增多,细胞生长情况良好,尤其是在蛋白处理组可发现更明显的细胞黏附生长情况. 结论：LARS人工韧带在体外实验中表现出良好的生物相容性,采用纤维连接蛋白表面预处理的方法简便、有效,能够有效增加材料的细胞相容性.     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞影响的实验研究

目的 探讨同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞粘附及分化的影响。方法 本实验取同种异体白兔皮质骨造成骨颗粒(直径100μ-500μ)，经低温冷冻(-70℃)一周后，与骨髓基质细胞(第二代)相结合进行体外培养(设为实验组)；另取未复合骨颗粒的骨髓基质细胞行体外培养(设为对照组)。两周后，倒置显微镜观察、光镜、四环素荧光标记、扫描电镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色等方法观测骨髓基质细胞的粘附及分化情况。结果 实验：光镜及电镜观察，细胞紧密贴附于骨颗粒表面，细胞体积较大，胞浆丰富，内含丰富的核糖体、粗面内质网、高尔基复合体和线粒体，部分线粒体基质内有致密的颗粒状沉积：四环素荧光染色后，有金黄色荧光结节出现；碱性磷酸酶染色显示，阳性率大于百分之七十。对照组：电镜观察，细胞多呈长梭型，核大，可见核仁，胞浆内有核糖体、线粒体、内质网；四环素染色呈阴性；碱性磷酸酶染色率为百分之四十。结论 同种异体颗粒骨可诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化；同种异体颗粒骨与骨髓基质细胞之间有较强的粘附作用；同种异体颗粒骨可用作骨组织工程细胞外基质替代物。     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

背景：L-聚乳酸可以用于制备骨组织工程支架材料，但存在某些缺陷，能否复合聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原来改善材料性能，从而找到新的组织工程化骨体外构建方法?目的：应用组织工程学技术，体外初步构建有活性的新型组织工程化人工骨。设计：体外构建细胞-材料复合体，自身对照前瞻性研究。地点和对象：本研究在解放军第三军医大学西南医院骨科和兰州铁道医学院复合材料研究所完成，对象为5例重庆市健康志愿者的髂骨骨髓。干预：培养、诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞表型分化，制备性能优越的新型支架材料，再按一定的方法体外构建细胞-材料复合体。主要观察指标：细胞碱性磷酸酶染色的阳性率、扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构。结果：由L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备出新型的骨组织工程复合支架材料，孔径300～450μm，孔晾率90．1％；细胞接种前碱性磷酸酶阳性率为(55&;#177;8)％，接种后细胞可在材料内良好贴附生长，碱性磷酸酶阳性率为(52&;#177;6)％，两者差异无显著性。结论：经成骨诱导的间充质干细胞，可以与由L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备的支架材料复合，在体外构建出组织工程化人工骨。     

不同类型骨组织工程支架材料的比较研究

目的:探讨本实验室所用的3类材料作为骨组织工程支架材料的可行性,寻找骨组织工程的最佳支架材料。方法:采用生物力学检测仪观察材料的强度;利用扫描电镜观察材料的立体结构;取4周龄兔骨髓,体外分离培养骨髓基质细胞,并加入诱导液,使细胞向成骨细胞分化,将细胞与支架材料共培养1,3,5,7d,通过倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在材料表面粘附、伸展及生长情况;将细胞与支架材料复合,并植入裸鼠背部皮下,植入4,8周后取材,行组织学检查,观察新骨形成情况。结果:3类材料均具有细胞复合成骨能力,其中珊瑚、珊瑚转化多孔羟基磷灰石(CHA)具有较为良好的物理性状、多孔性、细胞粘附性,及细胞复合成骨能力,作为支架材料更为优越。结论:珊瑚和珊瑚转化多孔羟基磷灰石(CHA)是骨组织工程比较理想的支架材料,与细胞复合为骨的再造及骨缺损修复开辟了新途径。     

骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的：利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞，在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法：实验于2002-04／12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB／c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取，小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基（含地塞米松10^-8mol／L、L广抗坏血酸50mg／L、β-甘油磷酸钠10mmoL／L Dulbecco改良的Eagle培养基液）培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较：取原代培养的骨髓基质细胞，分别加入转染指数25，50．100．200骨形态发生蛋白2腺病毒，以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞，测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：实验分5组：骨髓基质细胞组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d；骨诱导培养3d组，骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d；骨诱导培养9d组，骨诱导培养9d；骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组，骨诱导培养3d，加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d；骨形态发生蛋白2腺病毒组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d，加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞，测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测：采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果：应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加（P〈0．05）。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较：骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=25，100，200）组[（7658．53&;#177;1600．32）比（1932．89&;#177;665．30），（4311．53&;#177;1108．89），（5360．90&;#177;1374．61）．划内（2661．86&;#177;653．46）nkat／（g&;#183;L），P〈0．011。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组与骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组差异无显著性（P〉0．05），显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组（P〈0．05）。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论：单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化，但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2，从而提高了目的基因表达的效应。     

Ⅰ型胶原表面修饰生物活性多孔支架的细胞相容性

背景：前期研究已经成功制备了硫酸钙，冻干骨复合型生物多孔支架，但其表面的疏水性不利于细胞黏附、增殖。目的：观察Ⅰ型胶原表面修饰对硫酸钙，冻干骨复合型生物多孔支架亲水性和细胞相容性的影响。设计、时间及地点：体外细胞学对比观察，于2007—10／200806在山西医科大学第二医院骨科实验室及山西医科大学中心实验室完成。材料：应用Ⅰ型胶原进行表面修饰制备复合Ⅰ型胶原的硫酸钙／冻干骨复合型生物多孔支架。方法：将骨髓间充质干细胞分别与原支架（对照组）和表面修饰后的支架（实验组）复合培养。主要观察指标：测定表面修饰后支架的亲水性：扫描电镜观察表面改性后的材料及细胞与材料复合的形态学特征：分别使用MTT法、细胞蛋白质及碱性磷酸酶定量方法对细胞与材料复合培养后增殖与分化能力进行评估。结果：表面修饰后的新型多孔硫酸钙支架的亲水率高于原支架（P〈0．05）。实验组细胞的黏附率高于对照组（P〈0．05）；在培养的不同时期实验组的细胞数量、细胞的蛋白质含量及细胞碱性磷酸酶表达量均较对照组多（P〈0．05）。结论：Ⅰ型胶原表面修饰后的硫酸钙／冻干骨复合型生物多孔支架的亲水性和细胞相容性得到了显著提高。     

体外培养的成骨细胞与珊瑚复合的实验研究

目的：观察SD大鼠成骨细胞在珊瑚表面的贴附、伸展及生长情况，并探讨珊瑚作为骨组织工程支架材料与细胞复合植入体内的最佳时间。方法：分离的骨髓基质干细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养，5d后加矿化液诱地培养，分化为骨髓基质成骨细胞。将成骨细胞与处理过的珊瑚复合，通过细胞计数检测附着后的细胞生长增殖特性，并在扫描电镜下观察细胞在珊瑚表面的贴附情况。结果：细胞接种后，在材料表面贴附良好，继续增殖。结论：珊瑚的生物相容性良好，细胞贴附后继续保持成骨细胞的表型，作为骨组织工程的支架材料有较好应用前景。     

体外培养兔骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙的肌内成骨能力观察

目的：观察体外成骨诱导培养液条件下骨髓基质干细胞与细胞支架β-磷酸三钙体外复合培养后的成骨活性，以验证兔骨髓基质干细胞在体外向成骨细胞转化的能力，并进行对照比较。方法：实验于2003-10／2004-02在解放军第二军医大学长征医院骨科实验室完成。取健康成年新西兰大白兔7只，将抽取的骨髓置于加入地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C的DMEM标准培养液中培养。对获得的兔骨髓基质干细胞以倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等手段进行生长状态观察及生物学特性鉴定。然后将骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙体外复合培养1周后自体回植兔肌肉内，分别在4周和8周后取材，观察其成骨能力以组织学方法检测，并与未复合的β-磷酸三钙的细胞做自身对照比较。结果：实验选取的7只兔全部进入结果分析。①细胞的生长状况及形态特征：细胞全骨髓法培养24～48h，细胞开始贴壁，呈短梭形，贴壁细胞呈成纤维细胞集落方式生长。细胞培养5～7d，细胞集落生长逐渐密集，细胞体积逐渐增大，向长梭形转变，部分细胞呈多角形。②细胞生长曲线：传至第3代细胞，1～3d细胞增殖缓慢，为潜伏期，3～5d后细胞大量扩增，6d后细胞达到顶点进入平台期。第1，2，4代细胞的生长曲线基本与第3代相似。③细胞贴壁率：各代细胞的贴壁率未见明显差异，一般2h开始贴壁，2～8h前贴壁率增加较快，8～14h贴壁率达80％～90％。④细胞分裂指数：细胞早期分裂较慢，培养5～8d分裂指数最高，可达10％～15％。表现为胞核增大，双核增多。1～4代核分裂率基本相似。⑤细胞超微结构观察。结果：培养至第2代．骨髓基质干细胞透射电镜下细胞内开始出现大量胶原。⑥血清碱性磷酸酶检测结果：骨髓基质干细胞染色后，血清碱性磷酸酶显示红棕色沉淀，细胞密集区颜色较深。第3代细胞血清碱性磷酸酶染色阳性率可达85％以上。⑦细胞免疫组化Ⅰ型胶原检测结果：各代细胞Ⅰ型胶原免疫组化染色均为阳性．胞浆呈红棕色。⑧肌内成骨活性观察：骨髓基质干细胞／β-磷酸三钙复合物植入体内4周，可见新生骨样基质。8周后新生骨量明显增多，可见典型的骨组织结构。而未复合细胞的人工骨孔隙内仅见大量纤维结缔组织，体内培养4周及10周时均未见骨组织形成。结论：体外培养条件下，骨髓基质干细胞在条件培养液中具有与成骨细胞相似的形态特征、生长特点和功能性表现，短期内可以获得大量具有成骨能力的细胞。复合β-磷酸三钙载体后，出现异位成骨现象，为临床骨组织工程技术的研究提供了理论依据和参数。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的：建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式，比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。 方法：实验于2002-9／2004—3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞，颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化，用第2-4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜，Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构，通过生长曲线，比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性，并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。 结果：培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主，骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果：3种细胞的增殖能力依次为：骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察：第3代后3种细胞在形态上无明显的差别，在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞，骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达：骨膜来源成骨细胞第15天，颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成，骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节：矿化结节X射线能量散射分析，其Ga／P元素含量比值，骨膜来源成骨细胞为2．16&;#177;0．17，颅骨来源成骨细胞为2．39&;#177;0．21，骨髓基质干细胞为2．57&;#177;0．15；骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95．2％，颅骨来源成骨细胞为89．6％。骨髓基质干细胞（诱导后）为69．0％。骨髓基质干细胞（未诱导）碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为：骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。 结论：采用改良的酶消化法，培养骨、骨膜来源的成骨细胞，通过加以改进的密度梯度离心法，培养骨髓基质干细胞，可得到均一性好，活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

成骨诱导人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料的生物相容性

背景:纳米羟基磷灰石/聚酰胺66材料有利于成骨细胞的长入和新生骨的形成、且抗弯强度、抗压强度等各项参数与正常骨组织的力学性能相接近,能满足实验动物硬组织修复的要求.目的:分析成骨诱导后人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合支架的生物相容性.方法:体外培养人脐带间充质干细胞,纯化增殖,成骨诱导.取成骨诱导后的第3代人脐带间充质干细胞接种于纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料上,观察细胞的生长、增殖情况及材料细胞毒性.结果与结论:成骨诱导后人脐带间充质干细胞在复合支架上生长分化良好,增殖活性不受材料影响.成骨诱导14 d内,可见碱性磷酸酶活性随着培养时间延长而逐渐增高.MTT法检测细胞无毒性.扫描电镜观察,1 d后可见细胞在支架表面附着生长;7 d后可见细胞在材料上生长良好,材料空隙有大量充填.说明纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架可作为骨组织工程中人脐带间充质干细胞的细胞载体,具有良好的生物相容性,能满足骨组织工程的需要.     

地塞米松对骨髓细胞的诱导作用

目的：观察不同含量地塞米松对骨髓细胞的诱导作用，探讨骨髓作为骨组织工程种子细胞来源的可行性。方法：新生新西兰兔骨髓细胞取材，分别以含不同含量地塞米松的DMEM培养液进行培养。培养96h后，进行细胞计数、四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测和碱性磷酸酶(ALP)活性检测，评价细胞增殖和分化情况。结果：骨髓细胞生长增殖迅速。在不同含量地塞米松作用下，活细胞总数差异无显性意义，但细胞总数呈抛物线样变化趋势。同时，随着地塞米松含量的增加，ALP活性逐渐增强，表达成骨细胞表型水平增加，明显大于未加入地塞米松组。结论：地塞米松可以诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化，形成骨髓基质成骨细胞。地塞米松发挥诱导作用的同时，可能存在抑制旁路分化机制。骨髓可以作为良好的骨种子细胞来源用于骨组织工程研究和应用。