BMMSC输注对脐血CIK/NK细胞在荷瘤小鼠体内抗肿瘤效应的影响

目的 利用荷瘤小鼠来探讨不同的输注途径以及不同时间输注骨髓间充质干细胞( BMMSC)对脐血来源细胞因子诱导的杀伤(CIK)/自然杀伤(NK)细胞在体内抗肿瘤效应的影响。方法 NOD/SCID小鼠共56只,分为7组,每组小鼠经尾静脉输注K562细胞后12 h分别进行以下实验：同时经尾静脉输注人BMMSC+ CIK/NK细胞（A组）;经尾静脉相隔48 h分别输注人BMMSC和CIK/NK细胞（B组）;经小鼠胫骨骨髓腔输注入BMMSC,同时经尾静脉输注CIK/NK细胞(C组);经小鼠胫骨骨髓腔输注人BMMSC,48 h后经尾静脉输注CIK/NK细胞;经小鼠胫骨骨髓腔输注人BMMSC,48 h后经尾静脉输注CIK/NK细胞（E组）：较其他组延迟48 h经尾静脉输注CIK/NK细胞（F组）;除输注K562细胞外,不输注其他细胞（G组）。计算各组小鼠的生存曲线,检测小鼠外周血、骨髓、肝、脾和肺等脏器的肿瘤细胞负荷情况。结果 A、B、G组小鼠的存活时间短于C、D、E、F组(P＜0.05);A、B、G组间以及C、D、E、F组间小鼠的存活时间的差异均无统计学意义(P＞0.05);A、B、G组小鼠外周血、骨髓涂片中肿瘤细胞的比例高于C、D、E、F组(P＜0.05)。A、B、G组小鼠外周血、骨髓及肝、脾、肺组织匀浆中人肿瘤细胞标记CD33的表达率高于C、D、E、F组(P＜0.05);A、G组小鼠肝、脾、肺组织匀浆中CD33表达率高于B组(P＜0.05);C组小鼠肺组织匀浆中CD33表达率高于D组(P＜0.05)。结论 同部位注射BMMSC可明显抑制CIK/NK细胞在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用,而分部位注射,则BMMS的抑制作用明显减弱。提前输入的BMMSC在体内仍会削弱CIK/NK细胞的抗肿瘤作用。     

多重免疫缺陷NOD/SCID小鼠CD3~+ DX5~+细胞亚群与妊娠结局的关系

NOD/SCID小鼠具有T、B和自然杀伤(NK)细胞功能多重免疫缺陷。尽管如此,已证实在NOD/SCID小鼠体内仍残存一定量的NK细胞,具有一定的自然杀伤功能及残存的T细胞功能[1]。NKT细胞是一类同时具有T和NK细胞特征和功能的细胞。虽然数量很少,但因其兼有双重功能,而具特殊意义。CD3和DX5分别是成熟T细胞和NK细胞表面广泛表达特异性标志物[2]。本实验对NOD/SCID小鼠脾脏、腋下淋巴结(LN)和胎盘中NKT细胞(CD3 DX5 )的构成比和功能等进行初步研究,并与无免疫缺陷的BALB/c小鼠进行比较,研究NKT细胞亚群在妊娠免疫耐受等生理过程…     

DC疫苗对荷人前列腺癌免疫重建NOD/SCID小鼠的抑瘤作用

目的 探讨PC-3细胞冻融抗原致敏的树突状细胞(dendritic cells,DC)疫苗(PC-3-DC)对荷人前列腺癌免疫重建NOD/SCID小鼠(hu-PBL-NOD/SCID)的抑瘤作用.方法 采用人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)腹腔注射法建立hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型,随机分为实验组(PC-3-DC组)和对照组(DC组、PBS组),腹腔分别注射PC-3-DC疫苗、未致敏的DC和PBS.每周1次,共2次,然后接种1×107 PC-3细胞,观察鼠成瘤率、成瘤潜伏期、肿瘤体积以及测定特异性CTL活性.结果 ELISA法可检测到小鼠血清中人IgG水平,hu-PBL-NOD/SCID嵌合模型重建成功,各组小鼠间成瘤率无明显差异,但PC-3-DC组成瘤潜伏期延长,肿瘤生长缓慢,2周后肿瘤体积明显小于DC组和PBS组,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组脾淋巴细胞对PC-3细胞有特异性杀伤效应,而对K562细胞则无杀伤活性.结论 负载PC-3冻融抗原的DC疫苗可诱导人T淋巴细胞活化增殖,能有效抑制hu-PBL-NOD/SCID小鼠肿瘤的生长.     

人胆管癌CD24+ CD44+ EpCAMhigh细胞亚群的分选及其肿瘤干细胞样特性的鉴定

目的 检测及分选人胆管癌中的CD24+ CD44+ EpCAMhigh细胞亚群,探讨其是否具有肿瘤干细胞样生物学特性.方法 流式细胞术检测6例人胆管癌中CD24、CD44、EpCAM的表达率;取2例人胆管癌新鲜标本种植到NOD/SCID鼠皮下,建立荷人胆管癌小鼠模型.流式细胞术分选CD24+ CD44+ EpCAMhigh亚群细胞,NOD/SCID鼠移植瘤试验鉴定其成瘤和分化能力.结果 6例人胆管癌组织标本和2例移植瘤中,CD24+ CD44+ EpCAMhigh在人胆管癌中表达率为0.58%～2.43%(平均值0.94%).运用NOD/SCID鼠移植瘤模型,分选得到CD24+ CD44+ EpCAMhigh亚群细胞.NOD/SCID鼠移植瘤试验,1×103个CD24+ CD44+ EpCAMhigh细胞能成瘤(3/8),而CD24- CD44- EpCAMlow/-细胞在5×104才能成瘤(1/8).CD24+ CD44+ EpCAMhigh胆管癌细胞NOD/SCID鼠移植瘤的组织类型及标记物的表达率和原代肿瘤相似.结论 人胆管癌中含有CD24+ CD44+ EpCAMhigh细胞亚群,具有强成瘤能力、自我更新和分化的能力,可能是胆管癌干细胞.     

SCID鼠人肝癌皮下移植及免疫重建复合模型的建立

目的　探索建立稳定的SCID鼠人肝癌皮下移植及免疫重建 (人HCC PBL SCID)复合模型的方法。方法　经SCID鼠腹腔内注射人PBL、皮下接种人肝癌细胞 ,定期检测SCID鼠体内人淋巴细胞及其功能、观察皮下成瘤潜伏期及成瘤率。结果　人HCC PBL SCID复合模型鼠和单纯人HCC SCID模型鼠成瘤率均为 10 0 % ,但前者成瘤潜伏期显著延长、肿瘤明显缩小 (P分别 <0 0 1、<0 0 5 )。人HCC PBL SCID复合模型鼠第 2、4、6周时小鼠血中人IgG分别为 (6 9 8± 11 6 ) μg/ml、(12 5 9± 13 7) μg/ml和(183 1± 9 0 ) μg/ml,人CD3 淋巴细胞占单核细胞分别为 (10 5± 5 2 ) %、(9 7± 2 9) %和 (8 4± 2 4 ) %。复合模型鼠第 4、6周的小鼠脾细胞对HepG2细胞的杀伤力分别为 (2 0 3± 8 7) %和 (2 2 0± 2 3) %。免疫组化检测显示小鼠脾脏、胸腺、肿瘤组织中均有较多的人CD3 淋巴细胞分布。结论　采用腹腔注射人PBL、皮下接种人肝癌细胞的方法可以有效地建立人HCC PBL SCID嵌合模型。此模型较好地模拟了肝癌的人体内情况 ,是肝癌免疫基因治疗的较理想模型。     

重组人单核细胞趋化因子-1对荷骨肉瘤裸鼠的治疗作用

目的观察重组人单核细胞趋化因子－ 1 (monocyte chemoattractant protein－ 1,MCP－ 1)对骨肉瘤细胞种植及骨肉瘤生长的抑制作用。方法以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达人 MCP－ 1后予以提取、纯化。将 50只裸鼠分为 10组 :其中 A1～ 4组在接种 4.4× 106个骨肉瘤细胞的同时注射 MCP－ 1,剂量分别为 1μ g、 10μ g、 100μ g、 1 mg; B0～ 4组在骨肉瘤细胞接种 2周形成瘤体后局部隔日注射 MCP－ 1,剂量分别为 0μ g(0.2 ml生理盐水 )、 1μ g、 10μ g、 100μ g、 1 mg,共 20 d; C组为正常裸鼠注射生理盐水作空白对照。结果 A2～ 4组中 MCP－ 1明显阻止了骨肉瘤细胞的种植, A1组中极小剂量的 MCP－ 1也明显延迟其种植生长,抑瘤指数为 69.69％; A1～ 4组裸鼠血清碱性磷酸酶 (AKP)值明显低于 B0组,差异有非常显著性意义 (P< 0.01)。此外, MCP－ 1对已形成的骨肉瘤也具有一定的抑制作用, B3组抑瘤指数达 84.32％。病理检查示各组裸鼠的重要脏器未见明显损害。结论 MCP－ 1具有显著的阻抑骨肉瘤细胞种植、抑制肿瘤生长的作用,局部应用辅助其他治疗手段用于预防手术野内肿瘤细胞的种植具有重要的临床价值。     

氟他胺耐受前列腺癌动物模型的建立

目的建立SCID鼠前列腺癌氟他胺耐受模型。方法运用我们前期建立的氟他胺耐受前列腺癌细胞LNCaPflu(5×106个/0.1ml),结合应用Matrigel胶,将LNCaP细胞、LNCaPflu细胞分别各接种20只SCID雄鼠皮下,成瘤后将LNCaP细胞种植荷瘤鼠随机分为两组(LNCaP组、LNCaP/flu组),同时将LNCaPflu细胞种植荷瘤鼠也随机分为2组(LNCaPflu组、LNCaPflu/flu组),每组6只,其中LNCaP/flu组、LNCaPflu/flu组两组给予SCID鼠氟他胺20mg/kg体重皮下注射,每周2次,另2组作为对照组,动态观察肿瘤的生长状况。21d后测量瘤体大小,应用免疫组织化学方法检测种植瘤组织AR和PSA的表达。结果模型建立过程中,LNCaP细胞接种成瘤率75%(15/20),LNCaPflu细胞接种成瘤率60%(12/20),种植瘤组织组化染色AR均为阳性,而PSA均为阴性,未观察到肿瘤的远位转移。LNCaP组、LNCaPflu组、LNCaPflu/flu组3组间瘤重、瘤体积之间的差异无统计学意义(P>0.05),与LNCaP/flu组差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了前列腺癌细胞氟他胺耐受动物模型,为进一步研究并解决临床氟他胺耐受现象提供了重要的动物模型。     

纤维蛋白粘合剂包埋顺铂治疗腹膜移植瘤的研究

我们采用国产纤维蛋白粘合剂Fib rinGlue(FG)包埋顺铂 (cDDP) ,观测其缓释性并对比研究了对小鼠腹膜移植瘤的疗效。一、材料方法1.材料 :C5 6BL雌性纯系小鼠 ,18～2 2 g ;B16黑色素瘤细胞 ;原子光谱吸收仪 ;纤维蛋白粘合剂、顺铂。2 .建立鼠移植瘤模型 :每只小鼠腹腔内注射瘤细胞 8× 10 5个 / 0 .2ml,2 4h后开始处死鼠 ,每次 3只 ,每 2 4h 1次 ,开腹探查腹膜有无瘤结节形成。3 .体外缓释性实验 :FG分A、B两液 ,在B液中加入cDDP 5mg充分混匀 ,将两液经双管注射器直接喷于细胞培养瓶底部 ,形成固体胶块后 ,加入 5ml生理盐水NS浸泡 ,…     

造血干细胞移植抑制肝癌术后复发转移的实验研究

目的 证实异基因造血干细胞移植(allo hematopoietic stem cell transplantion,allo-HST)对严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠肝癌根治性切除术后的复发转移有一定抑制作用.方法 采集足月健康胎儿新鲜脐血,以6%羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)+NH4Cl破红细胞法分离人脐带血有核细胞(nucleated cells,NC).SCID小鼠22只随机分为A组:程序移植组(n=8);B组:单次移植组(n=8);C组:生理盐水对照组(n=6).两干细胞移植组内每只小鼠经尾静脉注入人脐带血NC共5×107个,三组小鼠移植前都给予低剂量的环磷酰胺预处理,并连续使用甲泼泥龙1周.6周后观测小鼠存活情况,流式细胞仪检测两干细胞移植组人源细胞嵌合情况.同时将HCCLM6肿瘤组织块原位接种于SCID小鼠肝脏,10 d后对荷瘤肝叶行根治性切除,4周后处死小鼠,观察肝内复发和肝外转移的情况.结果 通过化疗预处理及使用免疫抑制剂能够成功建立了人-鼠造血下细胞移植模型,程序移植组及单次移植组外周血CD3+细胞嵌合率分别为(1.66±0.47)%(0.68±0.56)%,差别有统计学意义(P<0.01).移植瘤切除后A、B、C各组肝内复发率均为100%,但复发瘤体积大小差异显著,分别为(367.18±31.86)mm3、(648.26±155.22)mm3、(811.38±127.36)mm3,两两比较差别均有统计学意义(P<0.01).A、B两组的抑瘤率分别为54.7%和20.1%.各组间肺转移率分别为14.3%(1/7)、66.7%(4/6)、100%(5/5),差别有统计学意义(P<0.01).淋巴结转移率分别为14.3%1(1/7)、33.4%(2/6)、40%(2/5),差别无统计学意义(P=0.58).结论 在小鼠实验中,造血干细胞移植对肝癌根治性切除术后的复发和转移显示出一定的抑制作用,并且随着人源细胞嵌合率的增加,抗肿瘤效应也相应得到提高.     

ICOS基因转染对CIK细胞杀伤胆管癌细胞作用的研究

目的 探讨转染可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator, ICOS)基因对细胞因子诱导杀伤(cytokine. induced killer, CIK)细胞杀伤胆管癌细胞的作用.方法 构建含ICOS基因的腺病毒载体并转染给CIK细胞(CIK-ICOS细胞组),单纯CIK及CIK-EGFP细胞为对照组,观察3组CIK细胞体外增殖与凋亡情况以及对胆管癌细胞的杀伤作用;ELISA法检测3组CIK细胞上清液中IFN-γ、IL-2及TNF-α的表达.建立胆管癌移植瘤的SCID小鼠模型,按随机数字表法将40只SCID小鼠分为生理盐水对照组、CIK、CIK-EGFP、CIK-ICOS细胞治疗组,观察转染ICOS基因的CIK细胞对小鼠胆管癌细胞的杀伤作用.结果 CIK-ICOS细胞组体外增殖明显强于CIK及CIK-EGFP细胞组;培养第20天CIK-ICOS与CIK细胞凋亡率分别为0.69%和2.90%,第23天分别为0.89%和4.92%;在不同效靶比CIK-ICOS细胞组杀伤效应均显著高于CIK与CIK-EGFP细胞组(F=13.37,6.46,25.51,P<0.05);CIK-ICOS细胞组上清液中IFN-γ的浓度为(49.50±4.73)μg/L,显著高于CIK细胞组(30.53±3.73)μg/L及CIK-EGFP细胞组(30.12±2.64)μg/L(F=38.89,P<0.05).CIK-ICOS细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显低于CIK与CIK-EGFP细胞治疗组,肿瘤坏死面积明显大于CIK与CIK-EGFP细胞治疗组,瘤内CIK细胞数量最多.结论 CIK细胞在体内外均具有杀伤胆管癌细胞的作用.转染ICOS基因后,CIK细胞体外存活时间延长、增殖能力增强、IFN-γ的表达增多,其在体内外抗胆管癌作用明显增强.     

Expansion of natural killer cells in patients with head and neck cancer: detection of "noninhibitory" (activating) killer Ig-like receptors on circulating natural killer cells

BACKGROUND: In a group of patients with head and neck cancers (H&NC), the expansion of the population of CD3-,CD16+ natural killer (NK) cells in the peripheral blood was studied. METHODS: Cytofluorimetric analysis of the expression of killer Ig-like receptors (KIR, namely p58.1, p58.2, p58.3, p70, and p140) and CD94-NKG2a was performed. Cytolytic activities were studied using 51Cr release assay. T and NK cell cloning was performed using limiting dilution culture conditions. Cytokine production was analyzed using commercial enzyme immunoassays. RESULTS: Phenotypic analysis showed that the expanded populations were heterogeneous. Even in the presence of a large number of circulating NK cells, "nonspecific" cytolytic capacities were heavily reduced, whereas cytolytic capacity related to T cells was virtually normal. Unlike NK cell clones derived from healthy donors, most NK cells derived from H&NC patients expressed surface "activating" NK cell receptors (KAR) for HLA, detected by use of a redirected cytolytic assay. Analysis of the CD4+ subpopulation at the clonal level demonstrated that they had a severe proliferative defect. CONCLUSION: These experimental data indicated that H&NC patients have a polyclonal expansion of functionally deficient NK cells expressing KAR. In addition, the proliferative capacity of patients' "helper" cells was strongly inhibited, thus accounting for a severe impairment of cytolytic activity of the expanded NK cells.     

Adoptive immunotherapy with adherent lymphokine-activated killer (A-LAK) cells in glioblastoma multiforme

Adherent lymphokine-activated killer (A-LAK) activity has been recently differentiated in recombinant interleukin-2 (rIL-2) activated PBL. A pilot study on A-LAK + rIL-2 injection into the post-surgical cavity of glioblastoma-operated patients is ongoing. Preliminary data support the feasibility of this technique, which may improve the antitumor response of the host.     

An adoptive immunotherapy of patients with medulloblastoma by lymphokine-activated killer cells (LAK)

An adoptive immunotherapy of 6 patients with medulloblastoma by lymphokine-activated killer (LAK) cells is described. They were from 2 to 9 years in age and had cerebrospinal fluid (CSF) dissemination of the tumours. All patients underwent the whole-neuraxis irradiation and chemotherapy. After the usual treatments, they were submitted to an adoptive transfer of one-haplotype identical LAK cells. The LAK cells were induced from peripheral blood lymphocytes (PBL) of their relatives with human recombinant interleukin-2 (rIL-2). 3 - 15 x 10(9) LAK cells were transferred intrathecally in 2-3 months. In 3 of 6 patients, neurological signs were improved and malignant cells had never been detected on CSF cytology after the adoptive immunotherapy. One among these 3 patients showed complete response in 20 months. Thus, this is an attractive approach for the treatment of medulloblastoma with CSF dissemination of the tumour which current therapeutic intervention can not cure.     

Allograft-infiltrating killer cells.

The allograft is infiltrated by several classes of killer cells carrying the relevant idiotypic receptor for alloantigen and being specifically cytotoxic to cells carrying the graft antigens.     

卡介苗激活杀伤细胞抗膀胱肿瘤作用研究

为了进一步探讨ＢＣＧ抗膀胱肿瘤的作用机理，采取１５例膀胱肿瘤患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），置于含ＢＣＧ或ＩＬ２的培养基中培养，计算扩增倍数，检测培养细胞抗自体及异体膀胱癌细胞活性。结果：卡介苗激活杀伤细胞（ＢＡＫ）与淋巴因子激活杀伤细胞（ＬＡＫ）分别于培养第７和第３天达增殖高峰，对自体瘤杀伤率分别为３６．２％和３１．４％，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）；对异体瘤杀伤率分别为２５．２％和２８．３％，差异无显著性。结果表明：ＢＡＫ细胞抗自体瘤活性高于ＬＡＫ细胞，死ＢＣＧ对ＰＢＭＣ无激活作用，ＢＡＫ细胞抗肿瘤效应可能是ＢＣＧ抗膀胱肿瘤重要作用机理之一。     

Operative stress potentiates the inductivity of membrane associated lymphotoxin (mLT) on lymphokine activated killer (LAK) cells in vitro

Membrane-associated lymphotoxin (mLT) is induced in human peripheral blood mononuclear cells when cultured with interleukin 2, in the form of lymphokine-activated killer (LAK) cells. The inductivity of mLT is thought to be dependent upon the differentiation potential of LAK cell precursors, being T cells and natural killer cells. In this study, we investigated the inductivity of mLT on LAK cells from surgical patients. The preoperative values of mLT inductivity were found to be generally higher in malignant than benign cases, and the postoperative time course of mLT inductivity showed a transient decrease immediately after the operation followed by gradual increase over 2 weeks. Moreover, patients with an intraoperative bleeding volume of more than 1,000 ml showed a delay in the postoperative increase of mLT inductivity. These data suggest that operative stress potentiates the inductivity of mLT on LAK cells; however, excess stress may cause a delay in the restoration of mLT inductivity.