Pten缺失小鼠胚胎成纤维细胞中活性氧和氧化损伤水平的研究

目的:研究Pten缺失后小鼠胚胎成纤维细胞抗氧化能力、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、脂质以及DNA氧化损伤水平的变化.方法:采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力检测、ROS荧光发光分析、丙二醛(malondialdehyde,MDA)舍量检测和γ-H2AX免疫荧光染色技术.分别比较Pten+/+ MEFs与Pten-/- MEFs细胞SOD活力、ROS、MDA和γ-H2AX水平的差异.结果:Pten-/- MEFs细胞中SOD活力明显减弱,ROS、MDA和γ-H2AX水平均显著增高.结论:Pten可能通过调控细胞抗氧化能力影响ROS水平,从而拮抗脂质和DNA氧化损伤以及由此产生的染色体不稳定性.     

基因芯片技术分析siRNA抑制多效生长因子表达后Pten-/- MEF241细胞基因表达谱的变化

目的:应用基因芯片技术,分析siRNA抑制Pleiotrophin基因表达后,Pten-/- MEF241细胞基因表达谱的变化.方法:选用Agilent公司的小鼠oligo芯片,分别提取siRNA抑制Pleiotrophin基因表达前后Pten-/-MEF241细胞的RNA,反转成cDNA,进一步荧光标记后进行芯片杂交,杂交结果经扫描及软件分析,最后Ration值为cy3/cy5(即实验组/对照组).差异基因筛选标准为正标Ratio(Cy3/Cy5)≥2同时反标Ratio(Cy3/Cy5)≤0.5.部分上调及下调基因的表达水平用RT-PCR及Northern杂交进行了验证.结果:siRNA介导Pleiotrophin基因沉默后,表达上调2倍以上的基因有240个,下调0.5倍以上的基因有129个.其中,上调10倍以上的基因有与DDK综合征相关的Schlafen家族成员Slfn2、3、4,基质蛋白金属酶Mmp3、10、13,白介素IL-1a、IL-f6等;下调5倍以上的基因有钙结合蛋白S100a8、视黄醇结合蛋白Rbp4、二肽酶Dpep1等.RT-PCR及Northern杂交验证结果与芯片结果吻合.结论:应用基因表达谱芯片成功分析了RNAi抑制Pleiotrophin基因表达后Pten-/- MEF241细胞基因表达谱的变化,挑选并鉴定出一批有意义的基因,为后续的深入研究提供了基础.     

核因子κB降低小鼠胚胎成纤维细胞中Lmp2基因转录

目的 研究在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中,核因子κB(NF-κB)对Lmp2基因转录的影响.方法 利用NF-κB荧光素酶报告基因检测MEF和c-abl/arg缺失株(DKO)中内源性NF-κB活性;构建包含Lmp2启动子序列和NF-κB结合序列突变体的荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶报告系统,研究NF-κB对Lmp2启动子转录活性的调控,并应用定量PCR、Western印迹比较Lmp2基因在MEF和DKO细胞中表达水平.结果 DKO细胞中内源性NF-κB活性上调;DKO细胞中Lmp2基因启动子的转录活性发生下调,并且NF-κB结合序列突变后,其转录活性升高;定量PCR和Western印迹结果表明,DKO细胞中Lmp2基因mRNA和蛋白表达水平比较MEF细胞均发生下调.结论 MEF中内源性NF-κB可负调控Lmp2基因转录,并降低其蛋白表达水平.     

PTEN基因敲除降低辐射敏感性及其机制

目的 探讨PTEN基因敲除对辐射敏感性的影响及机制。方法 采用流式细胞术检测MEF1和MEF1/PTEN^－/－细胞内ROS水平;采用Western blot方法,检测H₂O₂和DPI预处理后AKT激酶的表达变化;采用细胞克隆形成率试验分析细胞对⁶⁰Co γ射线的敏感性。结果 PTEN基因敲除后细胞ROS水平增加,辐射敏感性降低。H₂O₂和DPI预处理后影响MEF1细胞AKT激酶活性,但对MEF1/Pten^－/－细胞无影响。 结论 PTEN基因敲除阻断了ROS对AKT的介导,AKT激酶持续活化,可能是辐射敏感性降低的重要原因。     

多效生长因子基因沉默抑制PTEN基因敲除细胞的增殖

目的：在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子（pleiotrophin,Ptn）对细胞增殖的影响.方法：设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA （siRNA）寡核苷酸,构建至pSilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten^-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长的影响.结果：获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差.生长曲线结果显示,在Pten^-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten^-/-MEF241细胞的生长速度.结论：本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN 基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标.     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。     

成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠发生骨质硬化症

目的:研究Pten基因及其介导的PI3K/AKT信号通路在骨代谢平衡过程中的作用并建立相应的骨代谢疾病小鼠动物模型.方法:在利用Cre-LoxP系统获得成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠的基础上,利用X线摄影术、骨密度分析及组织学染色方法分析Pten基因敲除小鼠较野生型小鼠的骨量变化情况,进一步提取2种基因型小鼠骨组织RNA,通过实时定量PCR分析成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达情况.结果:获得了成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠,Pten基因敲除后小鼠的体型较野生型小鼠没有明显改变,但X线片、骨密度及组织学分析均表明Pten敲除小鼠骨量明显增加,发生了与人类骨质硬化症相类似的表型:此外,实时定量PCR的分析结果显示,成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达都有明显的升高.结论:成功地建立了Pten基因敲除骨质硬化症小鼠动物模型.     

白细胞介素1在多效生长因子对Schlafen2基因负性调控中的作用

目的:在多效生长因子(pleiotrophin,Ptn)基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞Ptn-siRNA B/MEF241中,研究白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)在多效生长因子对Schlafen2(Slfn2)基因负性调控中发挥的作用. 方法:本研究用Ptn-siRNA B/MEF241细胞的培养液培养对照NC细胞不同时间,通过Northern杂交检测NC细胞中Slfn2表达水平变化;应用RT-PCR和Western印迹检测外源性PTN因子(终浓度50 ng/μl)作用对Ptn沉默细胞内IL-1表达水平的影响;分别使用重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)和IL-1α中和抗体阻断IL-1的作用通路,检测Ptn稳定沉默细胞中Slfn2基因表达变化.结果:Ptn沉默细胞培养液可以诱导对照细胞Slfn2表达;外源性PTN能抑制沉默细胞中IL-1α和IL-1f6的表达;IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra) 和IL-1α中和抗体可抑制Ptn沉默细胞中Slfn2表达.结论:Ptn可能部分通过分泌性的细胞因子间接调控Slfn2基因表达,并且鉴定出在此调控过程中IL-1家族是其中一种非常重要的调控因子.     

肌细胞增强因子2D通过负向调控有丝分裂诱导基因6的表达促进肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721的增殖和迁移

目的观察肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D,MEF2D）对肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721增殖和迁移的影响,并探究其是否通过负调控有丝分裂诱导基因6（mitogen induced gene 6,MIG6）的表达发挥作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应技术分别检测肝癌细胞中MEF2D和MIG6转录水平的表达,以MEF2D mRNA表达量作为横坐标,以MIG6 mRNA表达量作为纵坐标,制作线性相关图;用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在PLC/PRF5细胞中下调MEF2D和MIG6后,通过细胞增殖与毒性测定试剂盒（7Sea-Cell Counting Kit,7Sea-CCK）和细胞划痕法检测肝癌细胞增殖和迁移能力;用siRNA在PCL/PRF5细胞中下调MEF2D、用MEF2D过表达质粒在SMMC7721细胞系中上调MEF2D后,通过蛋白印迹检测法分别检测MEF2D和MIG6的蛋白质表达水平。根据实验,共分为阴性对照（negative control,NC）组、siMIG6组、siMEF2D组、si2M（同时下调MIG6和MEF2D）组、空白对照组、空载对照组、MEF2D组7组。结果肝癌细胞hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、HepG2、7703、Huh7、Bel-7402中MEF2D mRNA、MIG6 mRNA表达水平呈现负相关关系（r=-0.78）。细胞增殖实验,24 h和48 h时,下调MIG6或MEF2D后,与NC组比较,siMIG6组或siMEF2D组中PLC/PRF5细胞增殖能力无显著变化;同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞增殖能力无显著变化。72 h时,各组间方差分析差异有统计学意义（F=20.68、P<0.01）;下调MIG6后,与NC组比较,siMIG6组中PLC/PRF5细胞增殖能力显著增强[光密度（optical density,OD）值为3.73±0.18,t=3.84、P=0.02];下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞增殖能力显著下降（OD=1.79±0.22,t=3.95、P=0.02）;同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞增殖能力增强（OD=2.99±0.03,t=4.83、P<0.01）。细胞划痕实验,各组间方差分析差异有统计学意义（F=42.27、P<0.01）;48 h时,下调MIG6后,与NC组比较,siMIG6组中PLC/PRF5细胞迁移能力显著增强[细胞迁移率为（51±4）%,t=3.22、P<0.05）];下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞迁移能力显著下降[细胞迁移率为（19±3）%,t=7.70、P<0.01];同时下调MIG6和MEF2D后,与siMEF2D组比较,si2M组中PLC/PRF5细胞迁移能力增强[细胞迁移率为（46±3）%,t=6.99、P<0.01]。蛋白质印迹检测,下调MEF2D后,与NC组比较,siMEF2D组中PLC/PRF5细胞MIG6蛋白表达水平显著上升（t=7.86、P<0.001）;上调MEF2D后,与空载对照组比较,MEF2D组中SMMC7721细胞MIG6蛋白表达水平显著下降（t=4.61、P=0.004）。结论肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721中MEF2D和MIG6表达量呈负相关关系,MEF2D很可能通过负向调控MIG6的表达从而促进肝癌细胞PLC/PRF5和SMMC7721增殖和迁移。     

LSM14A蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨RNA相关蛋白LSM家族成员14A(LSM14A)在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的功能及其潜在的分子机制.方法 通过慢病毒包装方法构建稳定敲低LSM14A的HepG2.2.15细胞株和稳定过表达LSM14A的HepG2.2.15细胞株,利用CRISPR/Cas9技术构建LSM14A敲除的HepG2.2.15细胞.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western印迹)检测敲低、过表达和敲除效果.利用RT-qPCR和Northern印迹杂交检测HBV RNA的表达水平;RT-qPCR检测HBV DNA的表达水平;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达水平.利用Western印迹检测下游分子,RT-qPCR检测干扰素的分泌.结果 在HepG2.2.15细胞中过表达LSMJ 4A可显著抑制HBV的复制,而敲低或敲除LSM14A可显著促进HBV的复制.过表达LSM14A后,p-TBK1、p-IRF3、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达水平均显著增加.结论 在HepG2.2.15细胞中LSM14A蛋白通过促进IRF3的磷酸化诱导Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达,进而抑制HBV的复制.     

Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS) - validation of a Swedish version

The Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS) is a self-administered instrument measuring outcome after knee injury at impairment, disability, and handicap level in five subscales. Reliability, validity, and responsiveness of a Swedish version was assessed in 142 patients who underwent arthroscopy because of injury to the menisci, anterior cruciate ligament, or cartilage of the knee. The clinimetric properties were found to be good and comparable to the American version of the KOOS. Comparison to the Short Form-36 and the Lysholm knee scoring scale revealed expected correlations and construct validity. Item by item, symptoms and functional limitations were compared between diagnostic groups. High responsiveness was found three months after arthroscopic partial meniscectomy for all subscales but Activities of Daily Living.     

Endovascular management of carotid-cavernous fistulas

Objective To investigate endovascular treatment of traumatic direct carotid-cavernous fistulas （CCF） and their complications such as pseudoaneurysms. Methods： Over a five-year period, 22 patients with traumatic direct CCFs were treated endovascularly in our institution. Thirteen patients were treated once with the result of CCF occluded, 8 twice and 1 three times. Treatment modalities included balloon occlusion of the CCF, sacrifice of the ipsilateral internal carotid artery with detachable balloon, coll embolization of the cavernous sinus and secondary pseudoaneurysms, and covered-stem management of the pseudoaneurysms. Results All the direct CCFs were successfully managed endovascularly. Four patients developed a pseudoaneurysm after the occlusion of the CCF with an incidence of pseudoaneurysm formation of 18.2% （4/22）. A total number of 8 patients experienced permanent occlusion of the ICA with a rate of ICA occlusion reaching 36.4% （8/22）. Followed up through telephone consultation from 6 months to 5 years, all did well with no recurrence of CCF symptoms and signs. Conclusion Traumatic direct CCFs can be successfully managed with endovascular means. The pseudoaneurysms secondary to the occlusion of the CCFs can be occluded with stent-assisted coiling and implantation of covered stents.     

The role of interventional radiology in trauma

Introduction Interventional Radiology has evolved into a specialty having enormous input into the care of the traumatized patient.In all hospitals,regardless of size,the Interventional Radiologist must consider their relationships with the trauma service in order to     

The acutely limping child

Acute limping may be the result of multiple pathologies in children. The differential diagnosis varies based on the age of the child. Irrespective of age, the initial imaging work-up includes AP and frog leg radiographs of the pelvis and ultrasound; MRI may sometimes be helpful. In children less than 3 years, infections and trauma are most frequent. MRI is the imaging modality of choice when osteomyelitis is clinically suspected. Between the ages of 3 and 10 years, transient synovitis of the hip and Legg-Calvé-Perthes disease are main considerations but infection, inflammation and focal bony lesions are also considered. In children over 10 years, slipped capital femoral epiphysis also is considered.     

Diagnóstico ecográfico del neumotórax

The ultrasonographic diagnosis of pneumothorax is based on the analysis of artifacts. It is possible to confirm or rule out pneumothorax by combining the following signs: lung sliding, the A and B lines, and the lung point. One fundamental advantage of lung ultrasonography is its easy access in any critical situation, especially in patients in the intensive care unit. For this reason, chest ultrasonography can be used as an alternative to plain-film X-rays and computed tomography in critical patients and in patients with normal plain films in whom pneumothorax is strongly suspected, as well as to evaluate the extent of the pneumothorax and monitor its evolution.     

Carbohydrate Supplementation during Exercise: Does It Help? How Much is Too Much?

KEY POINTS· Carbohydrate intake during exercise can delay the onset of fatigue and improve performance of prolonged exercise as well as exercise of shorter duration and greater intensity (e.g., continuous exercise lasting about 1h and intermittent high-intensity exercise), but the mechanisms by which performance is improved are different.     

人体中的镭-226、镭-228、钋-210、铅-210

本文报道了广东阳江高本底地区6名、对照地区8名人尸体的骨²²⁶Ra、²²⁶Ra的浓度以及部分居民内脏器官中。²¹⁰Po、²¹⁰Pb的浓度。结果轰明阳江高本底地区和对照地区居民骨镭-226、镭-228的浓度分别为29.9pCi/kg, 26.9pCi/kgl 8.7pCi/kg, 8.2pCi/kg.由此估算出阳江高本底地区屠民骨中²²⁶Ra、²²⁸Ra的负薄璧及对骨衬、骨髓所产生的剂量当量分别为对照地区民民的3.4倍, 3.3倍。两地区居民内脏器官中^{210Po、210Pb的测定分析铡数较少但仍看出, 高本底地区均明显高于对照地区.}     

磁共振DWI和动态增强鉴别颅底脊索瘤和侵袭性垂体瘤的应用

目的 探讨磁共振扩散加权成像(DWI)和动态增强在颅底脊索瘤和侵袭性垂体瘤(IPA)鉴别诊断中的应用价值.方法 搜集经手术病理证实且影像学有鞍区破坏的颅底脊索瘤患者15例、向鼻咽部侵犯的IPA患者20例.测量二者的表观扩散系数(ADC)值,绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析动态增强曲线的类型,统计达峰时间(TTP)、增强峰值(EP)和最大对比增强率(MCER),分析各个参数在鉴别诊断中的价值.结果 颅底脊索瘤的ADC值为(1.274±0.07)×10-3mm2/s,高于IPA ADC值(0.672±0.03) ×10-3 mm2/s(P ＜0.001),ADC阈值为0.964×10-3mm2/s时,ROC曲线下面积为0.997,敏感度为93.3％,特异度为100％.颅底脊索瘤时间-信号强度曲线(TIC)Ⅰ型14例,TICⅢ型1例,此例TICⅢ型者TTP约40 s;IPA TIC Ⅰ型7例,TICⅢ型13例.颅底脊索瘤和IPA的EP、MCER差异均有统计学意义(P ＜0.001).结论 ADC值和TIC的类型及其相关参数(EP,MCER)有助于颅底脊索瘤和IPA之间的鉴别.