人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光PCR定量标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(FQPCR)的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原(PSA)mRNA的表达。方法以Trizol裂解抽提法提取LNCaP细胞的总RNA。以RTPCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增;以AT载体克隆法制备重组质粒,并转化E.coliDH5α菌提取重组质粒,联合用氨苄青霉素筛选法和α筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达.方法:采用RT-PCR法利用肝组织提取的总RNA制备肝细胞生长因子cDNA目的片段.与pGEM-TEasy Vector连接成重组质粒并转化E.coli DH5α.联合用直接PCR、α互补和氨苄青霉素筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性.测定纯化的重组质粒A260,确定浓度并以此制备FQ-PCR梯度浓度参考标准.结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性.结论:成功构建了实时FQ-PCR定量参考标准.     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.     

ERAP1基因标准品质粒的构建

目的构建人ERAP1基因的重组质粒。方法以成人皮肤组织中总RNA为模板、Random6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人ERAP1基因,并克隆到PUC18载体,转化人大肠杆菌DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。计算重组质粒原液复制数浓度并制备梯度浓度标准品,real-timePCR构建标准曲线。结果ERAPl目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,标准品阈值循环数（α）与其相应梯度稀释浓度呈良好线性关系,扩增效率高。结论成功地构建了人ERAPl基因的荧光定量PCR标准品质粒。     

实时荧光定量PCR检测人APRILmRNA的标准品构建

目的:构建增殖诱导配体(APRIL)基因的重组质粒的标准品。方法:从肺癌的组织标本中抽提总RNA逆转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增目的片段,从胶中回收目的片段,再将回收的目的片段与pGEM-TEasy载体连接并转化宿主菌DH-5α,分别用菌落PCR及测序两种方法证实目的片段已成功转染细菌。抽提重组质粒DNA用核酸分析仪测浓度后换算成copies/ml。结果:成功构建了APRIL实时荧光定量标准品的线性范围105～1012copies/ml,批内与批间CV分别为1.34%～3.07%和7.24%～11.41%。结论:该法制备的质粒标准品具有较好的灵敏度和重复性,满足实时荧光定量实验要求。     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

不同双歧杆菌标准品制备法的比较研究

目的 比较不同的双歧杆菌标准品制备法,筛选适用于实时荧光定量PCR检测的双歧杆菌标准品。方法 以双歧杆菌标准菌株作为实验菌株,分别采用菌株DNA法、PCR产物扩增纯化法、质粒DNA法制备梯度浓度标准品,运用紫外分光光度计和实时荧光定量PCR 技术进行检测,并对数据进行统计学处理。结果 实时荧光定量PCR检测发现,3种不同的双歧杆菌标准品制备法的标准曲线均 r 2 ＞0.990;不同制备法的双歧杆菌标准品DNA浓度和纯度检测比较,质粒DNA制备法所制的双歧杆菌标准品浓度和纯度较另外两种方法高,差异有统计学意义（ P<0.01）。结论 双歧杆菌质粒DNA制备法制备的标准品质量较高,适用于实时荧光定量PCR检测,可以为双歧杆菌分子生物学检测提供参考依据。     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。