RNA病毒载体介导的基因转移进展

自1970年Baltimore和Temin两个实验室首次分离出逆转录病毒以来,针对RNA病毒的研究在世界各地蓬勃开展。特别是以RNA病毒作为疫苗和基因治疗载体的研究更是方兴未艾,本文对这方面的研究进展作一初步探讨。     

单磷酸阿糖腺苷对RNA病毒抑制的研究进展

<正>阿糖腺苷化学名为9-(β?D-呋哺阿拉伯糖腺嘌呤),是一种天然抗病毒化合物。最早通过化学全合成制备[1-2],后来逐步利用生物合成法合成。临床使用的是其单磷酸盐。本文综合了近年来国内有关单磷酸阿糖腺苷(Ara-Amp)用于部分RNA病毒治疗方面的研究,以期为Ara-Amp临床使用提供依据。1 RNA病毒核糖核酸病毒,又称RNA病毒,其遗传物质为RNA,相较于DNA病毒,具有较高的变异性。     

亚甲蓝光化学法降解丙型肝炎病毒核酸的研究

目的研究亚甲蓝光化学法（methylene blue photochemistry,MB-P）降解病毒核酸的作用机制,为该方法在临床血液制品病毒灭活中的应用提供理论依据。方法以丙型肝炎病毒（HCV）为研究对象,选择HCV基因组中相对保守的5′-NCR为模板,应用荧光定量PCR技术观察不同处理时间HCV RNA降解情况。同时,对体外转录的同区段的HCV RNA在无蛋白成分的代血浆（羟乙基淀粉20-氯化钠注射液）及PBS缓冲液中的降解模式进行分析。结果MB-P处理条件下,HCV RNA含量呈对数形式下降,该方法对体外转录RNA的灭活效率低于对血浆中病毒颗粒的灭活效率。结论亚甲蓝能作用于病毒核酸,在光照条件下使RNA迅速降解,从而达到病毒灭活的效果。     

不同消毒方式对流感病毒RNA消除效果的研究

目的研究不同消毒方法对流感病毒RNA的消除效率,筛选可用于环境中核酸污染清除的有效方法。方法将纯化的流感病毒RNA滴染在玻片上作为研究对象,经消毒作用后,采用荧光定量PCR评价不同消毒方式对流感病毒RNA的消除效果。结果中和剂鉴定试验显示中和剂、中和产物对PCR反应体系无显著影响。消毒剂对流感病毒RNA的清除试验显示,500 mg/L含氯消毒剂、500 mg/L二溴海因分别作用10 min后,RT-PCR检测结果均为阴性。5种过氧化物类消毒剂及二氧化氯作用30 min,Ct值小幅度升高。碘伏、乙醇、季铵盐消毒剂及紫外线照射消毒,对流感病毒RNA的清除效率很弱。结论含氯消毒剂及二溴海因对流感病毒RNA具有较好的消除效果。     

法国HCV RNA阳性供血者GBV-C/HGV标志物:HCV基因型和危险因素相关性分析

背景 通过反转录多聚酶链反应检测RNA或检测包膜蛋白E2抗体可以监测到OC型GB病毒/庚型肝炎病毒GBV-C/HGV感染。研究设计和方法 研究的目标是了解感染HCV的供血人群中HBV-C/HGV标志物感染阳性者的比例,及与HCV基因型和危险因素相关的GBV-C/HGV传播途径。结果 在306例HCV RNA阳性供血者中,GBV-C/HGV RNA阳性     

RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展

RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值。自1983年发明聚合酶链反应(PCR)技术以来，出现了基因扩增的概念。目前多采用核酸扩增技术(NAT)检测病毒RNA，最常用的是逆转录(RT)-PCR方法。核酸扩增检测想得到可靠的结果，必须使用质控品进行严格的质量控制，而对病毒进行定量测定，通常还须有病毒RNA标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品分为两大类，一是裸露的RNA片段，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armored RNA)。     

HCV RNA定量检测方法进展

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的病毒性传染病。HCV由于基因组的结构和表型特征而归属于黄病毒家簇单股正链RNA病毒，其病毒核酸（HCV RNA）的检测是诊断HCV感染敏感的特异于段。HCV RNA定量检测可用于血液及血液制品安全性监测、HCV发病机制及预后的研究、     

Aichi病毒在小儿腹泻中的研究进展

小儿腹泻病是世界范围内影响小儿健康的常见病和多发病,仅次于呼吸系统疾病。据报道每年约30～50亿人次的5岁以下小儿患腹泻病,导致近200万患儿死亡。小儿腹泻中病毒感染占85%～90%,细菌及其他感染占10%～15%。因此,病毒感染在小儿腹泻中占有重要地位,病原主要包括轮状病毒(RV,A组和C组)、肠道腺病毒(40和41型)、杯状病毒[包括诺如病毒(NoV)和札如病毒、星状病毒(AstV)]。此外,小核糖核酸(RNA)病毒(Aichi病毒)、小双节RNA病毒、细小病毒、人博卡病毒、新的小RNA病毒等,也可能与腹泻相关,对这些腹泻相关病毒的研究也日益受到人们的重视[1]。     

苏格兰供血者肠道病毒感染率、病毒载量、血清型鉴定

背景 肠道病毒为非包膜病毒、是频繁感染人类的RNA病毒。该病毒可能会通过输注处于抗体血清转换前病毒血症期的供者的血液或血液成份传播。为调查肠道病毒对输血安全的威胁,作者进行了一项大范围的供血者感染率和病毒含量检测调查。研究设计和方法 对苏格兰22个月里捐献的血液用PCR筛查了肠道病毒RNA。阳性样品用VP1的核酸序列进行     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究

目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.     

人T细胞白血病-淋巴瘤病毒

病毒能否引起人类白血病和淋巴瘤的问题一直受到关注。早在50年代初,Gross等即发现C型RNA病毒(逆转录病毒)与动物白血病、淋巴瘤的发病有关。从鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类(包括灵长类)动物的白血病细胞中均已分离到C型RNA病毒。人体内也找到过某些动物白血病病毒。但是长期以来并未掌握存在有人白血病、淋巴瘤病毒的确切证据。近几年来,许多作者报告找到了一种新的C型RNA病毒,即人T细胞白血病-淋巴瘤病毒(HTLV)。这种病毒系从某些类型的人类T细胞白血病、淋巴瘤细胞系中分离到,具有不同于各种动物C型RNA病毒或其他致人类     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景:慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率.目的:构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA 干扰慢病毒载体.方法:针对脯氨酰羟化酶2 基因序列设计RNA 干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP 连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA 干扰慢病毒表达载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.结果与结论:PCR 和DNA 测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA 慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP 载体.说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA 干扰慢病毒载体.     

甲病毒表达载体的特点及在核酸疫苗中应用

甲病毒属(Alphavirus)在病毒分类学上被归属于披膜病毒科(Togaviridae)。可以在蚊、禽类和哺乳动物的宿主细胞中复制。甲病毒基因组是一条单股正链RNA，其5’端为非结构蛋白编码区(NS1-NS4)，可编码病毒自身复制酶，主要与病毒的自身转录和复制有关。病毒感染宿主细胞或病毒基因组RNA转染细胞后，均可启动高水平的复制过程，迅速产生新的子代病毒颗粒，可在每个宿主细胞内达到105的高拷贝数。甲病毒在复制过程中，NS1—NS4序列首先翻译合成为一种能进行自身水解的多聚蛋白。多聚蛋白前体经自身剪切后形成4个非结构蛋白(NSP1—4)。它们是自身转录和复制所需要的酶，启动自身RNA的复制。在这些酶蛋白的作用下，以正链RNA为模板，合成全长的负链RNA，再以负链RNA为模板合成子代基因组正链RNA和编码病毒结构蛋白的mRNA，经过翻译合成病毒的结构蛋白。     

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。     

丙型肝炎患者外周血HCV RNA载量与DARC rs12075多态性的相关性

目的探讨丙型肝炎患者外周血HCV RNA病毒载量与DARC rs12075的相关性。方法以196例大连地区汉族HCV感染者为研究对象,使用TaqMan探针Real-timePCR技术对DARC rs12075进行分型。HCVRNA病毒载量测定采用Roche公司全自动核酸分离纯化检测系统COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan及其配套试剂。用豆形图展示HCVRNA病毒载量。结果 DARCrs12075分型结果显示,FY~*A/FY~*A基因型患者171例,其余为FY~*A/FY~*B基因型,未发现FY~*B/FY~*B基因型。对FY~*A/FY~*A基因型与FY~*A/FY~*B基因型患者间HCV RNA病毒载量进行比较,差异无统计学意义。进一步根据患者HCV RNA病毒载量不同将其分为4组,分别对各组不同基因型患者间HCV RNA病毒载量进行比较,差异均无统计学意义。结论丙肝患者外周血HCV RNA载量与DARC rs12075多态性无关。     

核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。     

两种核酸提取方法在丙肝病毒核酸定量检测中的应用比较

目的：比较两种核酸提取方法对荧光定量PCR测定丙肝病毒RNA的影响。方法：分别采用氯仿-异丙醇方法和核酸提取柱方法提取临床血清标本中的丙肝病毒RNA,荧光定量PCR法测定样本中丙肝病毒RNA含量,比较两种方法的重复性和准确性。结果：两种方法的灵敏度接近,对临床标本的测定结果有着良好的相关性,但核酸提取柱方法所得结果的重复性明显优于氯仿-异丙醇方法的重复性。结论：采用核酸提取柱方法处理标本,可提高丙肝病毒RNA定量检测的准确性。     

三种小干扰RNA干扰VP16 mRNA对单纯疱疹病毒-1复制的影响研究

目的探讨体外合成小干扰RNA(siRNA),在RNA干扰(RNAi)技术条件下,单纯疱疹病毒-1(HSV-1)感染Vero细胞过程中,病毒间层蛋白VP16的生物学功能。方法用T7RNA聚合酶体外合成针对VP16mRNA的三种siRNA。用脂质体2000转染Vero细胞后接种HSV-1,感染后不同时相点(12,24,36,48,60,72hpi)分别采取实验组(R)和对照组(C)标本,检测病毒滴度值,绘制子代病毒一步生长曲线。用同位素标记新合成的VP16进行免疫沉淀法检测病毒蛋白表达的变化。结果病毒子代一步生长曲线显示,转染siRNA的实验组Vero细胞接种HSV-1后24h(24hpi),病毒滴度明显低于对照组;12hpi也观察到病毒滴度低于对照组的现象;多位点的siRNA具有协同作用;实验组病毒滴度高峰出现时间后移大约12h。siRNA影响了病毒的蛋白表达。结论T7RNA聚合酶体外合成的siRNA可以用于RNAi技术研究;HSV-1间层蛋白VP16对病毒复制和组装、成熟起重要的生物学作用。     

RNA干扰技术及应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的细胞内双链mRNA特异性降解现象,属于转录后的基因沉默机制.RNAi是生物界普遍存在的抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制.目前已成功用于基因功能和信号转导的研究,在基因治疗方面也显现出良好前景.