小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增（PCR）目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH—KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT—PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。     

人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

目的:构建含神经生长因子(NGF)基因的重组慢病毒载体,并在293T细胞中验证NGF是否可以过表达。方法:将NGF基因克隆至慢病毒穿梭质粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP,然后利用酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证后,同两个辅助质粒共转染到293T细胞中,构建重组慢病毒载体。重组慢病毒感染293T细胞,通过荧光检测慢病毒的转染效果,用Western Blot检测NGF基因的表达。结果:酶切鉴定、PCR扩增鉴定和对重组慢病毒进行测序,提示重组慢病毒构建正确。荧光显微镜观察重组慢病毒感染的293T细胞,可见强荧光。Western Blot结果提示目的基因可正常表达。RT-PCR测得病毒滴度达到可利用标准。结论:人NGF重组慢病毒载体构建成功。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高（P〈0.05）,MOI值为10的组能获得〉70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究

目的 探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导红色荧光蛋白(RFP)基因转染人脑胶质瘤干细胞可行性和试验方法.方法用无血清干细胞培养基培养人脑胶质瘤干细胞,然后用细胞免疫荧光染色检测其干细胞特性表面标志物CD133、Nestin表达情况.以HIV-1来源的慢病毒为载体,以RFP基因为目的 的基因转染人脑胶质瘤干细胞,荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况及其转染率.MTT法检测转染后细胞与未转染RFP细胞组细胞增殖情况.再次用细胞免疫荧光染色检测转染后脑胶质瘤干细胞表面标志物CD133、Nestin表达情况.结果 红色荧光慢病毒转染胶质瘤干细胞体外连续培养后,RFP在干细胞中稳定表达,在荧光显微镜下即发出红色荧光,并且转染效率高.RFP- lentivirus转染后干细胞与未转染RFP组比较,生长曲线无明显差异,且转染后干细胞表面标志物仍表达阳性.结论 采用HIV-1来源的慢病毒载体介导以RFP基因为生物标记物标记人脑胶质瘤干细胞是可行的,以慢病毒转染对干细胞的生长影响小,转染效率高.     

人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-Fu-Shh的测序,Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合,判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。     

HGF慢病毒载体的构建及其转染脂肪来源间充质干细胞的实验研究

目的:本研究旨在构建携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的慢病毒载体,探索HG F慢病毒转染脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSC)的方法。方法:应用PCR法从带有HGF基因的质粒上钓取目的基因,克隆到GV287载体中。将重组GV287-HGF载体质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度,并转染ADSC。结果:HGF基因PCR产物电泳结果与预期大小一致,重组GV287-HGF质粒PCR产物电泳结果正确,酶切后产物测序分析所得结果与目的基因序列一致,含有HGF基因的重组慢病毒构建正确。通过ELISA法测得病毒滴度为5×108TU/ml。HG F重组慢病毒转染ADSC的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值为50。结论:本研究构建表达人HGF的慢病毒载体并成功转染ADSC,为进一步研究过表达HGF的ADSC,治疗放射引起的骨髓及重要脏器损伤奠定基础。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的：实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景:Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的:实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论:聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。     

构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体

背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变,而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因（BIRC5）,通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞,应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体,Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功,这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。     

造血干细胞研究发展历史引发的思考

本文简要地回顾了世界干细胞研究数十年的历史经过.它的原始研究是为了解决二次大战末在日本两次核爆炸中所见的致死性造血损伤,这也说明世界干细胞研究为什么从造血干细胞开始,而且人们长期不关心非造血干细胞在体内是否存在.20世纪50-60年代一些聪明设计的动物实验有力地暗示造血干细胞在体内的存在,动物研究又证实正常骨髓可以修复已严重破坏的骨髓,于是人们开始相信骨髓移植就是造血干细胞移植.培养造血祖细胞集落的陆续发现证明造血祖细胞的存在.直至上世纪90年代,有了NOD-SCID或羊胎等体内检测造血干细胞的可靠方法之后,才划清了造血干细胞和祖细胞的界限.本文列举了许多实例,说明实验血液学和临床血液学发展的互动性,以及其它生物学和技术的进步,尤其是免疫学和分子生物学的进步,极大地推动了干细胞基础研究和临床干细胞移植的发展.比如HLA、单克隆抗体、DNA分子克隆、基因重组工程技术以及近年发展的生物信息学、基因组学、蛋白质组学、干涉RNA、干细胞工程技术等,使干细胞基础和临床研究进入了21世纪的新时代.免疫治疗、间充质干细胞和干细胞工程的发展,结合用于造血干细胞移植,使细胞治疗多元化成为本世纪发展的新动向.本文着重地介绍了干细胞研究的每一步发展都同时出现认识上的误区,以及给干细胞研究带来了挫折.一个误区的澄清常常历时20甚至40多年之久.例如造血干细胞与祖细胞的区分;造血干细胞体外扩增研究在世界各国注定的失败;移植脐血缺乏的是造血干细胞,还是祖细胞;多数白血病是否起病于造血干细胞;以造血干细胞是否是基因治疗中最佳的外源基因载体;又如干细胞工程能否克隆实质脏器等等.在成体组织内存在成体干细胞是21世纪划时代的伟大发现,却也带来了误区和风波.本文重点分析了在成体干细胞发现的同时为什么会出现横向分化、去分化等缺乏科学根据的假说,以及部分同行视线混乱的根源与教训.文章指出误区的发生是由于缺乏实践和认识的片面性造成的,科学实践是检验和纠正认识片面性的唯一途径.整个干细胞研究的发展历史正是一个不断纠正认识误区的过程,也是必由之路.     

维甲酸诱导HL—60细胞分化与细胞周期的关系

研究全反式维甲酸（RA）在体外诱导人髓系白血病细胞系（HL-60）分化过程中细胞周期的改变。利用流式细胞术动态测定RA在体外诱导HL-60细胞分化过程中细胞周期的改变。结果发现：（1）在RA与IL-60细胞共培养48小时内，S G2/M期比例无明显变化，但S期细胞的比例改变与RA的浓度有关，在10^-6 mol/L RA浓度S期细胞比例先出现一过性升高，继而持续下降，在10^-5 mol/L浓度S期细胞比例表现为持续性下降；（2）重培养试验证明：S G2/M和S期细胞比例的下降与成熟分化细胞的增加相一致；（3）RA诱导HL-60细胞成熟分化并不是在一个时间点上同时进入分化状态，而一量细胞开始进入成熟分化，即使在无RA存在的情况下，细胞仍能分化至成熟。结论提示：RA与HL-60细胞必须相互作用一定时间后才能触发细胞成熟分化，S期细胞的比例改变与RA药浓度有关，一量细胞开妈进入成熟分化，即使在无RA存在的情况下，细胞仍能分化至成熟。     

A novel filtration system for point of care washing of cellular therapy products

The cell therapy industry would greatly benefit from a simple point of care solution to remove dimethylsulphoxide (DMSO) from small‐volume thawed cell suspensions before injection. A novel dead‐end filtration device has been designed and validated, which takes advantage of the higher density of thawed cell suspensions to remove the DMSO and protein impurities from the cell suspension without fouling the filter membrane. The filter was designed to avoid fluid circuits and minimize the surface area that is contacted by the cell suspension, thus reducing cell losses by design. The filtration process was established through optimization of the fluid flow configuration, backflush cycles and filter geometry. Overall, this novel filtration device allows for a 1 ml of thawed cryopreserved cell suspensions, containing 10⁷ cells of a fetal lung fibroblast cell line (MRC‐5), to be washed in less than 30 min. More than 95% of the DMSO and up to 94% of the albumin–fluorescein–isothiocyanate content can be removed while the viable cell recovery is higher than 80%. It is also demonstrated that this system can be used for bone marrow‐derived human mesenchymal stem cells with more than 73% cell recovery and 85% DMSO reduction. This is the first time that a dead end (normal) filtration process has been used to successfully wash high‐density human cell suspensions. In practice, this novel solid–liquid separation technology fills the need for small‐volume washing in closed processing systems for cellular therapies. Copyright © 2016 John Wiley & Sons, Ltd.     

丙戊酸钠抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡与分化

为进一步研究丙戊酸钠(sodium valproate;VPA)对白血病细胞HL-60的增殖、凋亡和分化的影响,采用MTT法检测不同浓度的VPA对HL-60细胞增殖的作用;细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;NBT还原实验结合形态学作为观测细胞分化指标;应用流式细胞术检测不同浓度药物作用后细胞周期的变化及凋亡细胞的比例。结果显示:VPA能明显抑制HL-60的增殖;经2mmol/L VPA处理24-48小时后,HL-60出现胞浆空泡、核固缩、核碎裂及凋亡小体;Annexin V阳性的早期凋亡细胞比例由2.9%升高到17.1%;流式细胞术检测出明显的亚二倍体峰;G1期细胞由51.1%增加至84.6%,S期细胞由37.9%减低至14.4%。0.25mmol/L VPA作用1周后,促进HL-60细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化,NBT阳性细胞百分率为(47±2)%。结论:VPA能明显抑制白血病细胞HL-60的增殖,并诱导其分化及凋亡。     

低氧对间充质干细胞的影响

氧对于几乎所有的生命都是必需的,它维持能量代谢及细胞的功能,但机体多种细胞是处于生理或病理性低氧状态中,而体外细胞实验一般是在20%氧浓度下进行,并不符合生理状态。直到最近,关于低氧对于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）的影响有了一系列的研究。体外实验表明,适度低氧下MSC的生长和存活能力更好,氧浓度可以影响MSC向成骨、成软骨、成脂的分化倾向,低氧能提高特异性受体和配体相结合所介导的迁移。低氧可影响胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞的生理学特性也是一证据。干细胞对缺氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子-1（hypoxic inducible factor-1,HIF-1）信号通路。本文综述了低氧对MSC的存活、增殖、分化和迁移的影响,以及涉及HIF-1等的分子机制。     

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤12例临床分析

为了探讨血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)的临床、病理特征及预后情况,回顾性分析了经病理检查证实的12例AITL患者的临床特点、病理形态及免疫表型、治疗和生存情况。结果表明:12例患者主要症状为全身淋巴结肿大,9例伴有发热等全身症状。确诊依据淋巴结活检,病理组织学呈现淋巴结结构破坏,免疫母细胞增生,树枝状血管增生的特点,免疫表型全部为成熟外周T细胞性。12例患者均用CVP为主的化疗方案,总有效率58%。3年生存率为25%,全组中位生存25个月。结论:AITL临床过程呈侵袭性,进展快,中位生存期短,预后差,应探索更为有效的治疗方案。     

Comparison of in vivo red cell survival of donations collected by Haemonetics MCS versus conventional collection

The Haemonetics Multicomponents System (MCS) cell separator allows concurrent donation of red cells in addition to platelets and/or plasma, thus increasing the versatility of apheresis donations. In vivo survival of autologous red cells obtained by MCS was compared with red cells collected conventionally. In this cross-over controlled study, five male volunteers donated one unit of red cells by MCS and one unit of whole blood by the conventional manual method, 3 months apart. After storing donations in SAG-M for 35 days under standard conditions, radioactive (⁵¹Cr)-labelled autologous red cells were injected into each donor. The post-transfusion recovery (PTR) of red cells at 24 and 48 h did not show any significant difference between red cells obtained manually and by MCS, indicating that processing differences have no detrimental effects on red cell survival.     

六亚甲基二乙酰胺诱导HL-60细胞分化及其分子机制的研究

本研究探讨六亚甲基二乙酰胺（HMBA）对髓系白血病HL-60细胞分化的作用及其分子机制。应用MTT比色法观察不同浓度HMBA在不同时间点对细胞增殖的抑制作用，采用Wright—Giemsa染色观察细胞形态学变化，运用流式细胞仪测定细胞分化抗原CD11b的表达，并进行细胞周期分析，半定量RT—PCR分析c-myc、mad1、p21、p27、hTERT、HDAC1基因mRNA的表达。结果表明：HL-60细胞经不同浓度（0．5、1、2mmol/L）HMBA处理后细胞增殖受到较明显的抑制，并随时间延长、剂量增大抑制作用明显增强。HL-60细胞经2mmol／L HMBA处理后，细胞形态学上趋于分化成熟，细胞停滞于G0／G1期；CD11b表达显著增高；c-myc、hTERT mRNA表达显著下调，mad1、p21、p27mRNA表达显著上调，而HDAC1 mRNA表达无明显变化。结论：HMBA能诱导HL-60细胞分化，其分子机制可能是通过调节c-myc／mad1开关引起p21、p27上调，并且下调hTERT mRNA表达，与HDAC1活性抑制无关。     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

红景天苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响

本研究旨在探索红景天苷对骨髓MSC增殖及干细胞因子（SCF）分泌的影响.应用密度梯度离心和贴壁培养法,体外分离并扩增MSC,应用流式细胞术和成脂及成骨诱导法进行MSC鉴定,并观察红景天苷对MSC增殖、细胞周期及分泌SCF的影响.结果表明,红景天苷可影响MSC的增殖,以1.5 mg/ml浓度刺激MSC增殖作用最强,在24、48、72 h内存在一定的时间依赖性,并且红景天苷明显增加S、G1/M期细胞比例,尤以1.5 mg/ml作用明显.应用1.5 mg/ml红景天苷与MSC共培养48 h,其培养上清中SCF含量明显上调（P＜0.01）,其mRNA表达也明显增加（P＜0.01）.结论：在一定剂量浓度下红景天苷对MSC有明显增殖促进作用,并可提高MSC的CSF基因表达和分泌.