体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法

背景：肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞,但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。目的：探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。方法：构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型,通过酶消化和Percoll梯度离心分离纯化大鼠异质卵圆细胞并进行免疫染色鉴定,用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外长期培养,后撤去表皮生长因子、白血病抑制因子,通过形态学的观察和分子标志物的检测判断其能否保持干/祖细胞活性。结果与结论：采用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外培养卵圆细胞4个月后,大鼠异质卵圆细胞仍能表达肝细胞标志物ALB、胆管上皮细胞标志物CK-19,经不含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养液继续培养后,卵圆细胞胎肝标志AFP表达量迅速下降。该研究结果表明大鼠肝卵圆细胞在表皮生长因子、白血病抑制因子等培养条件下可长期增殖并保持干细胞活性。     

脂质体介导pBLAST2—hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞

背景:在体外将外源基因导入肝细胞相当困难,而利用肝脏干细胞导入外源性基因较为容易.目前大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立已较为成熟,但作为原代细胞,肝卵圆细胞的稳定培养和传代是较为困难的.目的:建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染大鼠肝卵圆细胞的细胞株,观察转染细胞的生物学特性.方法:取稳定培养的第4代雄性Lewis大鼠肝卵圆细胞,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到肝卵圆细胞,然后在倒置显微镜下观察转染细胞的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定转染细胞的稳定培养条件,使用western blot和ELISA方法检测转染细胞hHGF蛋白的表达.结果与结论:第4代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的肝卵圆细胞在培养基中添加不同剂量和种类细胞因子的条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/肝卵圆细胞迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,western blot方法检测转染细胞有hHGF蛋白表达,ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高.结果提示,使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于肝卵圆细胞,转染细胞具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究.     

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。目的:探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。方法:取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代,流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导:①M0组:不添加任何因子。②M1组:20μg/L肝细胞生长因子。③M2组:20μg/L肝细胞生长因子+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组:20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组:20μg/L肝细胞生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色,在诱导第14天时表达降低,21d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P<0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用,二者有协同作用。     

受体来源肝卵圆细胞在移植肝内种植后的增殖与分化

背景:肝卵圆细胞移植后对受损肝脏具有修复作用.目的:观察受体来源肝卵圆细胞对受体大鼠术后生存期及肝功能的影响.方法:采用二袖套法建立大鼠原位肝移植模型,供体为雌性DA大鼠,受体为雌性Lewis大鼠.造模后随机分为对照组(不进行细胞移植)、实验组(移植过程中供肝经门静脉和肝动脉注射受体来源肝卵圆细胞1×109 L-1).结果与结论:实验组术后撤他克莫司后的中位生存期和累积生存率均优于对照组(P < 0.05),移植肝肝细胞受损情况弱于对照组(P < 0.05),移植肝合成和排泄功能明显好于对照组(P < 0.05).表明在移植肝脏内种植受体来源肝卵圆细胞可有效改善移植肝功能,并且明显延长受体生存时间,提高累积生存率,该结果可能与受体来源肝卵圆细胞在移植肝内增殖分化,修复受损肝脏和减轻急性排斥反应有关.     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型技术难点评价及免疫组织化学鉴定

目的介绍改良大鼠肝卵圆细胞增殖模型建模中的技术难点,对卵圆细胞进行形态学观察及免疫组织化学鉴定。方法建立改良的大鼠肝卵圆细胞增殖模型,设模型组和假手术组,观察大鼠肝组织结构变化、卵圆细胞增殖情况及OV6、CD34、E-Cadherin的免疫组织化学定位。结果假手术组大鼠肝组织内仅见少量卵圆细胞,模型组可见明显肝卵圆细胞增殖反应,肝卵圆细胞胞浆、胞膜OV6、CD34、E-Cadherin染色呈阳性。模型组大鼠肝组织OV6、CD34、E-Cadherin蛋白表达的灰度值均比假手术组高(P<0.01)。结论改良模型可获得满意的大鼠肝卵圆细胞增殖,其增殖部位由汇管区小胆管旁向肝小叶内延伸。     

β-catenin在肝卵圆细胞中的表达及意义

目的：研究β-catenin在肝卵圆细胞中的表达和意义。方法：利用2-乙酰氨基芴／部分肝切除（2-AAF／PH）建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，利用免疫组化方法研究其中β-catenin和CycinD1表达情况。结果：β-catenin主要表达于肝细胞的细胞膜上，但在肝卵圆细胞，可见胞浆和胞核均有β-catenin的表达。CycinD1只表达于肝卵圆细胞，而肝细胞未见表达，且CycinD1主要定位于细胞核上。讨论：WNT信号途径也参与了肝卵圆细胞活化的过程和肝卵圆细胞的增殖和分化相关。[著者文摘]     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景:研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段.目的:观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子4等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力.方法:采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第3代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化.于诱导7,14,21 d后观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的mRNA表达;于诱导14,21 d行PAS糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达.结果与结论:随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟.细胞诱导至7 d出现甲胎蛋白mRNA表达,14 d表达增高,21 d时表达下降;14 d时细胞角蛋白18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加.细胞诱导14 d时,胞浆白蛋白出现表达,至21 d时表达增强.证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子4等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力.     

肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导入脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多.当肝细胞生长因子质量浓度达1 μg/L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂.目的:体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/2009-04在暨南大学血研所完成.材料:脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供.肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品.方法:Ⅳ型胶原酶消化+差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力.取第5代细胞.调整细胞密度为5×10~9 L~(-1),分为2组:对照组用含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养;诱导组在其基础上,添加20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化.主要观察指标:人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况.结果:成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92.2%处在G_0/G_1期;表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45;油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力.经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10 d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达.结论:人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化.     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子 4 等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第 3 代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导 7,14,21 d 后观察细胞形态变化,RT-PCR 检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的 mRNA 表达;于诱导 14,21 d 行 PAS 糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至 7 d 出现甲胎蛋白 mRNA 表达,14 d 表达增高,21 d 时表达下降;14 d 时细胞角蛋白 18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导 14 d 时,胞浆白蛋白出现表达,至 21 d 时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4 等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少.目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法:采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基.诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化.结果与结论:诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞.     

脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察

目的探讨脐带血单个核细胞在体外定向分化为肝细胞的条件及能力,为建立脐血干细胞移植治疗慢性肝衰竭提供实验依据。方法采集脐带血分离单个核细胞后,在实验组加入成纤维细胞生长因子(FGF)及促肝细胞生长因子(HGF)、或FGF加胎肝上清液培养,对照组只加FGF培养,观察细胞生长分化状况,免疫组化检测两组人甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)。结果实验组可见类圆形及多边形细胞,呈类肝细胞形态,对照组大多为梭形细胞,未见多边形细胞;实验组细胞AFP、Alb免疫组化染色为阳性,对照组未见AFP,Alb阳性细胞。HGF的诱导分化效果优于胎肝上清液。结论脐带血单个细胞在HGF或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌Alb及AFP的类肝细胞。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.     

胚胎干细胞体外分化为功能性肝细胞过程中肝细胞生长因子诱导系统中瘀胆血清的促进作用

背景:目前各种诱导胚胎干细胞(ESC)分化为肝细胞的方法中,大多忽略了对分化细胞功能的诱导与鉴定。是否表达肝细胞功能应作为ESC向肝细胞分化的鉴定指标之一。目的:观察在肝细胞生长因子(HGF)体外诱导小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的体系中,瘀胆血清病理环境对分化细胞表达肝细胞功能的作用。设计:观察对比,体外细胞学实验。单位:中山大学附属第二医院肝胆外科。材料:实验于2004-10/2007-02在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。小鼠E14ESC系由中山大学干细胞与组织工程中心提供;SD大鼠20只,鼠龄2周,购自中山大学动物实验中心。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。方法:对SD大鼠施以胆总管结扎切断手术,制作瘀胆模型,饲养10d后取全血制备瘀胆血清。用悬滴培养ESC发育5～7d的拟胚体,将其离散细胞种植于不同的分化体系,分别进行自主分化、20μg/L肝细胞生长因子、5%瘀胆血清 20μg/L肝细胞生长因子诱导分化。主要观察指标:①倒置显微镜下动态观察细胞形态变化。②分化4周时进行白蛋白、甲胎蛋白、CK18/19、糖原及吲哚氰绿和荧光二乙酯染色。③采用相应试剂盒每3天检测细胞合成白蛋白、三酰甘油及尿素氮功能。结果:①ESC自主分化难以控制,分化为3个胚层的细胞。肝细胞生长因子促进ESC向内脏内胚层和中胚层(心肌)分化,但两者仅能表达低水平的肝细胞特异性功能。②引入瘀胆血清的肝细胞生长因子诱导体系中ESC能分化为较为形态均一的多角形细胞,其糖原、吲哚氰绿和荧光二乙酯染色均为阳性;白蛋白、三酰甘油和尿素氮合成能力显著高于自发分化和肝细胞生长因子诱导结果(P<0.05～0.01)。结论:采用瘀胆血清体外模拟病理性微环境可促进HGF诱导的ESC源性肝细胞表达高水平的肝特异性代谢功能。     

第3～5周人胚肝的细胞特征和生长因子及其受体表达

背景:早期肝的发育与横隔间充质和原始心脏的发育在时间和空间上存在密切关系,来自原始心脏和横隔间充质的信号分子可诱导前肠内胚层细胞向肝细胞的特化,横隔间充质为肝芽的形成提供了一个适宜的环境,并可促进其生长和分化。但这一诱导过程的分子机制尚不清楚。目的:利用发育第3～5周人胚标本,选择甲胎蛋白、细胞角蛋白19、c-Met作为肝干细胞的标记物,观察早期人胚胎的发育及肝干细胞的形态特征,以明确肝干细胞的特征和影响其增殖、分化的因素,为肝干细胞的基础研究和临床应用提供实验依据。设计:开放性实验。单位:潍坊医学院人体解剖学教研室。材料:实验于2004-09/2005-01在成都医学院科研中心完成。选择2个月内流产的新鲜人胚胎标本20例,20min内用40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、连续切片,苏木精-伊红染色,显微镜下观察,参照Jirasek的人胚发育分期标准,根据胚胎的长度、体节的数目及器官发育状况确定胚龄。方法:选择胚龄第3～5周的标本,SABC法进行免疫组织化学染色。多克隆抗肝细胞生长因子、c-Met、胰岛素样生长因子I及其受体、转化生长因子β1、转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2抗体,单克隆抗增殖细胞核抗原、甲胎蛋白和细胞角蛋白19抗体,4℃孵育过夜,羊抗兔或羊抗鼠IgG及SABC液室温下分别孵育2h,二氨基联苯胺显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察、拍照。主要观察指标:第3～5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色,肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I及其受体在第3～5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达。结果:①第3～5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色观察:第3周末肝芽形成,第4周肝芽的细胞伸入横隔间充质内形成肝索,构成肝索的细胞具有与第3周末相同的形态特点。第5周时这些细胞数量明显增加,细胞体积有所增大,胞核嗜碱性稍减弱,胞质的嗜酸性增强,但细胞的形态仍均匀一致。第3～4周时肝索的细胞呈增殖细胞核抗原的反应阴性,5周时开始出现阳性反应,主要分布在细胞核,少数细胞的胞质为弱阳性。第3～5周时多数肝索细胞都为甲胎蛋白和c-Met阳性,甲胎蛋白阳性细胞的免疫反应沉淀物在胞核、胞质及细胞膜中均存在;c-Met阳性反应主要分布于细胞核,胞质亦可见较弱的阳性反应。而这些细胞为细胞角蛋白19阴性。②肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I及其受体在第3～5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达:发育第4周组成肝索的细胞表达c-Met,而不表达其他的因子或受体。第5周时,除了肝细胞生长因子以外的其他因子均在肝索细胞表达。转化生长因子β1及其受体转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2的免疫反应沉淀物主要存在于细胞质和细胞膜,胰岛素样生长因子I及其受体的阳性反应在细胞核、细胞质以及细细胞膜均可见。第3～5周时,肝芽或肝索周围的心肌细胞和间充质细胞呈肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I免疫反应阳性,阳性信号主要聚集在细胞质,少数胞核亦有阳性。结论:①人胚胎发育的第3周末,前肠腹侧的部分内胚层细胞特化为肝干细胞。②发育第3～5周人胚肝的细胞为未分化的肝干细胞,若拟研究人胚肝干细胞,此时取材、并利用肝干细胞特异性的标记物,可得到具有双向分化潜能的肝干细胞。对于鼠胚肝干细胞的研究,也可利用人、鼠胚龄的对应关系,推算出其肝干细胞存在的时间、从而决定取材的时间点。③肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子I、转化生长因子β1等生长因子促进早期人胚肝的发育。     

不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

背景：研究证实在多种微环境下可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞,但诱导条件及诱导分化率尚无定论,选择合适的诱导剂及诱导剂浓度尤为重要。目的：观察肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最适浓度。方法：不同浓度肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导培养原代兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,并检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、白蛋白表达及肝细胞合成功能。结果与结论：随诱导时间延长,可观察到多极性的肝细胞样细胞。7d时甲胎蛋白表达阳性,14d达最大值后即开始下降（P〈0.05）,此后各浓度组间表达无差别（P〉0.05）。14d时白蛋白表达阳性,随时间延长,阳性细胞数递增（P〈0.05）,且细胞生长因子浓度越高,阳性细胞数越高（P〈0.05）。诱导早期（9～15d）白蛋白上清液中白蛋白水平与诱导剂浓度成正比（P〈0.05）。18d或21d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别（P〉0.05）。结果显示高浓度的肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子可提高骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化率,诱导剂最适浓度为肝细胞生长因子60μg/L、表皮细胞生长因子4.5mg/L。     

Adenovirus-mediated fibroblast growth factor 1 expression in the lung induces epithelial cell proliferation: consequences to hyperoxic lung injury in rats

High concentrations of oxygen can induce pulmonary toxicity and cause injury to alveolar epithelial and endothelial cells. The present study was performed to determine whether the potent epithelial and endothelial fibroblast growth factor 1 (FGF-1) protected against hyperoxia-induced lung injury. Recombinant adenovirus carrying the gene encoding human secreted FGF-1 (Ad. FGF1) increased the proliferation of lung epithelial cells in vitro. Ad.FGF1 or control vector with an empty expression cassette (Ad.V152) was administered intratracheally to Wistar rats. With Ad.FGF1 (10(9), 5 x 10(9), 10(10), or 5 x 10(10) viral particles [VP]), FGF-1 protein was found in bronchoalveolar lavage fluid 4 days postinfection at levels proportional to the viral dose and was detected in plasma after doses of 10(10) VP or more were administered. Histological examination of the lungs showed intense proliferation and apoptosis of alveolar and bronchial epithelial cells, with few inflammatory cells. The alveolar architecture returned to normal within 17 days. Rats pretreated with Ad.FGF1 (10(9) or 5 x 10(9) VP) 2 days before exposure to hyperoxia (95% O2) survived, whereas rats pretreated with Ad.V152 died within 3 days. In conclusion, adenovirus-mediated FGF-1 overexpression in the lungs causes epithelial cell proliferation and has beneficial effects in hyperoxic lung injury.     

不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

背景:研究证实在多种微环境下可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞,但诱导条件及诱导分化率尚无定论,选择合适的诱导剂及诱导剂浓度尤为重要。目的:观察肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最适浓度。方法:不同浓度肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导培养原代兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,并检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、白蛋白表达及肝细胞合成功能。结果与结论:随诱导时间延长,可观察到多极性的肝细胞样细胞。7d时甲胎蛋白表达阳性,14d达最大值后即开始下降(P<0.05),此后各浓度组间表达无差别(P>0.05)。14d时白蛋白表达阳性,随时间延长,阳性细胞数递增(P<0.05),且细胞生长因子浓度越高,阳性细胞数越高(P<0.05)。诱导早期(9～15d)白蛋白上清液中白蛋白水平与诱导剂浓度成正比(P<0.05)。18d或21d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别(P>0.05)。结果显示高浓度的肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子可提高骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化率,诱导剂最适浓度为肝细胞生长因子60μg/L、表皮细胞生长因子4.5mg/L。     

TWEAK induces liver progenitor cell proliferation

Progenitor ("oval") cell expansion accompanies many forms of liver injury, including alcohol toxicity and submassive parenchymal necrosis as well as experimental injury models featuring blocked hepatocyte replication. Oval cells can potentially become either hepatocytes or biliary epithelial cells and may be critical to liver regeneration, particularly when hepatocyte replication is impaired. The regulation of oval cell proliferation is incompletely understood. Herein we present evidence that a TNF family member called TWEAK (TNF-like weak inducer of apoptosis) stimulates oval cell proliferation in mouse liver through its receptor Fn14. TWEAK has no effect on mature hepatocytes and thus appears to be selective for oval cells. Transgenic mice overexpressing TWEAK in hepatocytes exhibit periportal oval cell hyperplasia. A similar phenotype was obtained in adult wild-type mice, but not Fn14-null mice, by administering TWEAK-expressing adenovirus. Oval cell expansion induced by 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) was significantly reduced in Fn14-null mice as well as in adult wild-type mice with a blocking anti-TWEAK mAb. Importantly, TWEAK stimulated the proliferation of an oval cell culture model. Finally, we show increased Fn14 expression in chronic hepatitis C and other human liver diseases relative to its expression in normal liver, which suggests a role for the TWEAK/Fn14 pathway in human liver injury. We conclude that TWEAK has a selective mitogenic effect for liver oval cells that distinguishes it from other previously described growth factors.     

连接蛋白/缝隙连接细胞间通讯对大鼠肝卵圆细胞增殖调控作用

背景：缝隙连接蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）是细胞间最重要的信息交流形式。目的：验证CX/GJIC对卵圆细胞的增殖调控作用。方法：Wistar大鼠分为4组。对照组正常饮食;2-AAF/PH组按改良Solt-Farber法建立卵圆细胞增殖动物模型;苯巴比妥组予以苯巴比妥饮水7d,第8天按2-AAF/PH组建模,苯巴比妥饮水持续至实验结束;三七总皂苷组按2-AAF/PH组建模时予以三七总皂苷25mg/（kg？d）腹腔内注射,并持续实验结束。结果与结论：造模后肝脏连接蛋白呈时空特异性表达,先下调后逐渐恢复,连接蛋白43表达于卵圆细胞,先升高后逐渐恢复;采用苯巴比妥改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32、连接蛋白43时空表达模式后,可下调肝脏的GJIC,减少卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,解除卵圆细胞生长抑制,促进卵圆细胞的增殖;三七总皂苷可以增加大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32表达、滞后连接蛋白43的表达,增加卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长;通过下调大鼠2-AAF/PH模型肝脏的GJIC,可使卵圆细胞增殖早、增殖水平高;上调GJIC使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长,CX/GJIC可以调节体内卵圆细胞的增殖、分化过程。