第3～5周人胚肝的细胞特征和生长因子及其受体表达

背景：早期肝的发育与横隔间充质和原始心脏的发育在时间和空间上存在密切关系，来自原始心脏和横隔间充质的信号分子可诱导前肠内胚层细胞向肝细胞的特化，横隔间充质为肝芽的形成提供了一个适宜的环境，并可促进其生长和分化。但这一诱导过程的分子机制尚不清楚。 目的：利用发育第3～5周人胚标本，选择甲胎蛋白、细胞角蛋白19、c—Met作为肝干细胞的标记物，观察早期人胚胎的发育及肝干细胞的形态特征，以明确肝干细胞的特征和影响其增殖、分化的因素，为肝干细胞的基础研究和临床应用提供实验依据。 设计：开放性实验。 单位：潍坊医学院人体解剖学教研室。 材料：实验于2004-09／2005-01在成都医学院科研中心完成。选择2个月内流产的新鲜人胚胎标本20例，20min内用40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、连续切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察，参照Jirasek的人胚发育分期标准，根据胚胎的长度、体节的数目及器官发育状况确定胚龄。 方法：选择胚龄第3-5周的标本，SABC法进行免疫组织化学染色。多克隆抗肝细胞生长因子、c—Met、胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体、转化生长因子β1、转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2抗体，单克隆抗增殖细胞核抗原、甲胎蛋白和细胞角蛋白19抗体，4℃孵育过夜，羊抗兔或羊抗鼠ⅠgG及SABC液室温下分别孵育2h，二氨基联苯胺显色。以磷酸盐缓冲液代替-抗作阴性对照。光学显微镜下观察、拍照。 主要观察指标：第3～5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色，肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体在第3-5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达。 结果：①第3-5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色观察：第3周末肝芽形成，第4周肝芽的细胞伸人横隔间充质内形成肝索，构成肝索的细胞具有与第3周末相同的形态特点。第5周时这些细胞数量明显增加，细胞体积有所增大，胞核嗜碱性稍减弱，胞质的嗜酸性增强，但细胞的形态仍均匀一致。第3～4周时肝索的细胞呈增殖细胞核抗原的反应阴性，5周时开始出现阳性反应，主要分布在细胞核，少数细胞的胞质为弱阳性。第3～5周时多数肝索细胞都为甲胎蛋白和c—Met阳性，甲胎蛋白阳性细胞的免疫反应沉淀物在胞核、胞质及细胞膜中均存在；c—Met阳性反应主要分布于细胞核，胞质亦可见较弱的阳性反应。而这些细胞为细胞角蛋白19阴性。②肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体在第3—5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达：发育第4周组成肝索的细胞表达c—Met，而不表达其他的因子或受体。第5周时，除了肝细胞生长因子以外的其他因子均在肝索细胞表达。转化生长因子β1及其受体转化生长因子β受体l、转化生长因子β受体2的免疫反应沉淀物主要存在于细胞质和细胞膜，胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体的阳性反应在细胞核、细胞质以及细细胞膜均可见。第3-5周时，肝芽或肝索周围的心肌细胞和间充质细胞呈肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ免疫反应阳性，阳性信号主要聚集在细胞质，少数胞核亦有阳性。 结论：①人胚胎发育的第3周末，前肠腹侧的部分内胚层细胞特化为肝干细胞。②发育第3-5周人胚肝的细胞为未分化的肝干细胞，若拟研究人胚肝干细胞，此时取材、并利用肝干细胞特异性的标记物，可得到具有双向分化潜能的肝干细胞。对于鼠胚肝于细胞的研究，也可利用人、鼠胚龄的对应关系，推算出其肝干细胞存在的时间、从而决定取材的时间点。③肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子Ⅰ、转化生长因子β1等生长因子促进早期人胚肝的发育。     

大鼠胚胎肝干细胞标记物的筛选

目的筛选大鼠胚胎肝脏组织特异性表达的mRNA,寻找肝干细胞的特异性标记物。方法取成年大鼠肝脏2个、2周胚龄大鼠胚胎肝脏2个作为标本。提取标本的RNA,反转录合成cDNA,再体外转录合成cRNA,同时进行标记。将cRNA纯化后进行杂交、洗涤、染色,对芯片进行扫描。将基因芯片数据进行处理与分析,筛选出目的基因。免疫组化方法检测各相关蛋白在胚胎肝脏组织中的表达。结果筛选出787个在大鼠胚胎肝脏组织中高表达的差异表达基因,涉及8个类别。免疫组化检测发现,高迁移率族蛋白A1(HMGA1)在2周胚龄多数胚肝胎细胞中表达阳性,阳性信号多分布于细胞质。结论大鼠胚胎肝脏组织发育相关的差异表达基因筛选可采用基因芯片,HMGA1是大鼠胚胎肝干细胞特异性标记物。     

血管内皮生长因子及其受体和angiopoietin及其受体在人胚胎造血过程中的作用

背量：血管内皮生长因子家族及其受体在血管生成和新血管形成过程中具有重要作用。近来，有关血管内皮生长因子家族对血液发生的作用受到广泛关注。 目的：观察血管内皮生长因子A、血管内皮生长因子C及其受体和alI．giopoietin-1（ang-1）、angiopoietin-2（ang-2）及其受体在发育第3-12周人胚胎卵黄囊血岛、主动脉-生殖腺-中肾区的表达，以了解血管内皮生长因子和angiopoietin家族在血液发生过程中的作用。 设计：单一样本观察。 单位：潍坊医学院，形态实验中心和解剖学教研室。 对象：实验于2002-02／2004-08在潍坊医学院进行，收集流产的47例孕妇的受糟龄第3-12周人胚胎标本，孕妇知情同意。 方法：标本连续切片，每隔10张抽出2张切片，分别做苏木精一伊红染色和免疫组织化学染色。多克隆抗血管内皮生长因子C，fms样酪氨酸激酶，flt-4，ang-1，ang-2，Tie-2抗体以及单克隆抗血管内皮生长因子A，胎肝激酶l抗体4℃孵育过夜，羊抗鼠IgG及SABC液室温下分别孵育2h，DAB显色。分别以正常兔或鼠血清代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察、拍照。 主要观察指标：①血管内皮生长因子A和血管内皮生长因子C及其受体在发育第3-12周人胚胎卵黄囊血岛、主动脉-生殖腺-中肾区的时空表达。②ang-1和ang-2及其受体在发育第3-12周人胚胎卵黄囊血岛、主动脉-生殖腺-中肾区的时空表达。结果：①第21-25天人胚卵黄囊血岛血管内皮细胞和造血细胞强表达血管内皮生长因子A及其受体fms样酪氨酸激酶和胎肝激酶l、血管内皮生长因子C及其受体胎肝激酶4、ang-2及其受体Tie-2蛋白，弱表达ang-1蛋白。②背主动脉和中肾于发育第4周开始表达上述各种因子及其受体，免疫阳性反应物集中在大而圆、有核的造血细胞。阳性细胞的数量到第7周到达高峰。8周以后，阳性细胞数量显著减少，到12周，几乎所有的血细胞为免疫阴性反应。③生殖腺主要在第6-8周表达血管内皮生长因子A，fms样酪氨酸激酶，flt-4，ang-1,ang-2和Tie-2蛋白，但不表达血管内皮生长因子C和胎肝激酶l。④主动脉一生殖腺一中肾区的血管内皮细胞未检测到上述各因子的表达。 结论：人胚卵黄囊血岛造血细胞和内皮细胞以及背主动脉和中肾共表达多种与血管发生和血液发生相关的因子。人胚内造血发生于第4周。     

ABC 转运蛋白在肝细胞癌中的表达及意义*

目的:探讨P-gp、MRP1、BCRP 等ABC 转运蛋白在肝细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:应用RT-PCR 和免疫组织化学方法检测P-gp/MDR1、MRP1、BCRP等mRNA 及蛋白在34例的肝细胞癌、19例癌旁肝组织中的表达。结果:MDR1、MRP1、BCRP等mRNA 在肝癌组的相对表达水平分别为1.15± 0.24、0.64± 0.33、1.07± 0.32,在癌旁肝组织组的相对表达水平分别为0.36± 0.14、0.19± 0.06、0.31± 0.09。MDR1、MRP1、BCRP 在肝细胞癌中低分化组（Ⅲ、Ⅳ级）为1.38± 0.26、0.73± 0.35、1.34± 0.21,在高分化组（Ⅰ、Ⅱ级）分别为0.74± 0.32、0.30± 0.11、0.45± 0.13。P-gp、MRP1、BCRP等的阳性反应产物主要分布于细胞膜和胞浆内;在肝癌组和癌旁肝组织组的阳性表达率分别为82.35% 、58.82% 、79.41% 和42.11% 、26.32% 、36.84% 。P-gp、MRP1、BCRP在肝细胞癌中低分化组（Ⅲ、Ⅳ级）的阳性表达率分别为100% 、81.25% 、100% ,在高分化组（Ⅰ、Ⅱ级）的阳性表达率分别为66.67% 、38.89% 、61.11% 。RT-PCR 及免疫组织化学均显示,P-gp、MDR1、MRP1、BCRP mRNA和蛋白在肝癌组的表达均高于癌旁肝组织组,且在低分化（Ⅲ、Ⅳ级）肝癌组织的表达高于高分化者（Ⅰ、Ⅱ级）,差异有统计学意义（P<0.05）。 MDR1、MRP1、BCRP之间的表达无线性相关。结论:在肝细胞癌中存在原发性多药耐药现象,且多种耐药机制并存。P-gp、MDR1、MRP1、BCRP等与肝细胞癌的耐药有关,在肝癌组的表达高于癌旁肝组织组,且在肝细胞癌中的表达随着肿瘤分化程度的增高而降低,可作为肝细胞癌多药耐药性作用的靶点。      

LRP、GST-π在肝细胞癌中的表达及意义

目的：探讨LRP、GST-π在肝细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法：应用RT—PCR和免疫组织化学方法检测LRP和GST-π mRNA及蛋白在34例的肝细胞癌、19例正常肝组织中的表达。结果：LRP和GST-π mRNA的表达在肝癌组为0．53±0．28、0．75±0．19,正常肝组织组为0．22±0．10、0．26±0．12,差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组化结果显示,LRP和GST-π的阳性表达率在肝癌组为55．88％、67．65％,在正常肝组织组为21．05％、31．58％,差异有统计学意义（P〈0．05）。LRP、GST-π mRNA和蛋白在肝癌组的表达高于正常肝组织组,且低分化（Ⅲ、Ⅳ级）肝癌组织的表达高于高分化者（Ⅰ、Ⅱ级）（P〈0．05）,LRP与GST-π之间的表达无线性相关。结论：在肝细胞癌中存在原发性多药耐药现象,且多种耐药机制并存。LRP、GST-π在肝细胞癌中高表达,且随着肿瘤分化程度的增高而降低。     

第3～12周人胚肝甲胎蛋白及细胞角蛋白1 9和c-Met的时空表达

背景:现阶段对于肝干细胞在胚胎肝发育过程中的形态学特征、时空分布、分化过程的报道很少.目的:以甲胎蛋白、细胞角蛋白19、c-Met作为标志物,观察其在不同发育阶段肝干细胞中的时空分布.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2006-12在潍坊医学院中心实验室完成.材料:40例胚胎标本取自3个月内的流产胎儿,由潍坊医学院附属医院提供.方法:收集流产胚胎,30 min内制作切片,显微镜下根据胚层形成情况、体节数目及器官发育状况确定胎龄.选择胎龄第3～12周的标本切片,每隔10张抽出1张切片,行免疫组织化学染色.主要观察指标:第3～12周胚胎肝干细胞甲胎蛋白、c-Met、细胞角蛋白19的表达.结果:第3～5周甲胎蛋白、c-Met呈阳性反应,提示为肝干细胞;第10～12周甲胎蛋白、c-Met阳性细胞主要分布于汇管区周围,提示此时肝干细胞主要局限于汇管区周围的肝索内,与成年肝中卵圆细胞(成年肝干细胞)的分布一致.细胞角蛋白19阳性反应在第7周时开始出现;第10～11周时细胞角蛋白19阳性反应主要位于汇管区附近的肝索细胞和胆管板细胞及胆管上皮细胞;第12周时细胞角蛋白19阳性信号仪见于胆管板和胆管上皮细胞.此时所有的胆管板细胞及胆管上皮细胞均呈甲胎蛋白、c-Met和细胞角蛋白19阳性.结论:细胞角蛋白19在肝干细胞中无表达,仅在胆管上皮细胞及其祖细胞中有表达,可能不适合作为肝干细胞的标志物.所有的胆管板及胆管上皮细胞均呈甲胎蛋白、c-Met、细胞角蛋白19阳性反应,推测甲胎蛋白+/c-Met+/细胞角蛋白19+的细胞可能为胆管祖细胞.     

胎肝滤液诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

目的 探讨胚胎肝组织滤液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为肝细胞的诱导条件,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。 方法 在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测肝细胞标志物;PAS检测糖原表达;靛青绿染色检测转化细胞的分化程度;测定细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量以检测其功能状态。 结果 BMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变;甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)免疫反应、PAS反应和吲哚靛青绿(ICG)摄入实验及上清液中ALT、AST、ALP等酶均在诱导的第7天开始出现,AFP和ALB免疫反应在21d时达高峰;PAS反应和ICG摄入实验随着时间的延长而增强;上清液中的各个酶在14d达高峰,之后呈下降趋势。 结论 胎肝滤液可诱导BMSCs形成具有肝细胞形态和功能特点的细胞。     

视神经管减压术的解剖与临床研究进展

视神经损伤是头部外伤的严重并发症,其发生率占头部外伤的0.5%～5%[1].由于解剖结构的特征,视神经损伤主要发生在视神经管内段.目前,早期应用大剂量皮质激素和视神经管减压术仍是治疗外伤性视神经损伤的主要手段.临床上,视神经管减压术的入路方式较多,本文对视神经管减压术的术式及解剖学基础进行综述.     

叶绿素显示液对狗胃淋巴结显色的实验研究

目的:探讨叶绿素显示液对狗胃淋巴结显色的应用价值。方法:13只成年狗分为A:对照组(1只)和B:实验组(12只),B组于胃壁内注射叶绿素显示液,观察胃16组淋巴结的染色情况,并在不同时间(1、2、4、8、24h)取显色淋巴结作光、电镜观察;从狗股静脉采血,测定血清中叶绿素的含量。结果:注射叶绿素显示液后,狗胃各组淋巴结很快显色(1～5min)。光镜下观察到叶绿素进入淋巴结的被膜下窦和小梁周窦。电镜下观察,淋巴结皮质、髓质细胞内、单核细胞和巨噬细胞内可见叶绿素颗粒;叶绿素在血液中的浓度,4h最高,为350.46μg/ml;之后随时间变化逐渐减少。结论:(1)叶绿素显示液是一种理想的淋巴染色物质,染色迅速,与周围组织对比明显,且染色后无不良反应和并发症。(2)经胃壁内注射叶绿素显示液,能够有效显示胃的各组淋巴结,可提高胃淋巴结的清除率及避免损伤周围组织。