异位成骨材料修复新西兰兔桡骨干骨缺损

目的探索异位成骨材料修复新西兰兔桡骨干骨缺损的可行性。方法13只新西兰白兔(4周龄,体质量1.5 kg)作为实验动物。取新西兰白兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导,2周后予碱性磷酸酶染色确认其成骨活性。取诱导后的间充质干细胞悬液与β-磷酸三钙生物陶瓷共培养,3天后植入4只新西兰白兔股骨骨膜旁。于植入后第8周收取异位成骨材料,行骨组织切片检查。取8只新西兰兔,制作桡骨干骨缺损动物模型,并将其均分为实验组(4只)和对照组(4只),分别植入异位成骨材料和β-磷酸三钙生物陶瓷修复骨缺损,于术后4、8、12周行手术侧X线摄片,术后12周取修复处骨,行组织切片检查。结果异位成骨植入第8周见植入物成骨完整,获取的成骨材料组织切片显示与股骨干骨细胞结构相似。骨缺损修复动物实验术后X线摄片显示,实验组修复效果显著优于对照组;术后12周修复处骨组织切片显示,实验组新生骨与周边骨组织边界消失,融合度好,骨小梁密度高,新生血管较多。结论异位成骨材料可用于兔桡骨干骨缺损修复。     

骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究

目的:探索骨髓间充质干细胞膜片的体外构建简便方法,并评估其成骨分化潜能。方法:将兔骨髓间充质干细胞高密度接种,在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。通过组织学、碱性磷酸酶活性定量检测、透射电镜和扫描电镜等方法,检测细胞膜片的特性。结果:高密度连续培养及成骨诱导后形成骨髓间充质干细胞膜片。HE染色证实膜片是一种由多层细胞和细胞外基质组成的聚集体;茜素红染色呈阳性;碱性磷酸酶定量分析含量较高;扫描电镜及透射电镜检查均见基质中大量的矿化结节聚集。结论:通过体外简单的连续培养和成骨诱导后,可形成具有良好成骨能力的骨髓间充质干细胞膜片。     

新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究

目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞,按照经典组织工程构建方法,分别接种双相磷酸钙（对照组）和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石（实验组）支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况;MTT法检测细胞增殖功能;碱性磷酸酶（ALP）检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组,差别有统计学意义（P〈0.01）。结论：新型BCP支架与兔BMSC在体外具有良好的相容性,二者具有体外构建工程骨的潜力。     

生物复合材料体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞分析

目的探讨生物复合材料HA-玻璃涂层/多孔ZrO2体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞的能力,找到骨髓间充质干细胞理想的复合载体及移植后的安全性,为骨缺损的临床快速恢复治疗奠定基础。方法通过生物材料体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞,培养至14天、21天,经Gomori钙钴法染色、Von Kossa染色及Ⅰ型胶原免疫组化分析比较诱导前后其碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原的表达变化;流式细胞技术检测诱导前后细胞CD45、CD44及CD90的表达变化。结果 SD大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导14天,出现了三角形或不规则细胞,细胞之间界限清晰,碱性磷酸酶呈阳性表达;诱导至21天,细胞中出现致密圆形的矿化结节及Ⅰ型胶原呈阳性表达,细胞之间界限模糊;流式技术检测诱导前后细胞表面CD44仍为阳性表达,CD45仍为阴性表达,而CD90由原来的阳性表达转为阴性表达,细胞表达阳性率由99.7%下降为0.29%。结论该生物复合材料将骨髓间充质干细胞成功诱导为成骨细胞,且该材料又能与骨形成很强的化学结合,用作骨缺损的填充材料,为新骨的形成提供支架,发挥骨传导作用。     

瘦素对人牙髓干细胞骨向分化作用的实验研究

目的：探讨瘦素（leptin）对人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,hDPSCs）增殖和骨向分化的影响。方法：采用酶消化法体外培养人牙髓干细胞,分别加阶梯浓度leptin处理,通过四唑盐（MTT）比色试验和碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）活性测试来检测瘦素对牙髓干细胞体外增殖分化的影响;再将人牙髓干细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙材料制作为复合体植入免疫缺陷裸鼠,12周后采用组织学和免疫组化方法检测体内生成物。结果：瘦素对人牙髓干细胞细胞增殖无明显促进作用,但leptin能促进人牙髓干细胞碱性磷酸酶的活性表达;体内试验证明leptin可提高牙髓干细胞向成成牙本质细胞分化及生成类牙本质的能力。结论：瘦素对人牙髓干细胞的增殖活性无明显作用,但人牙髓干细胞与羟基磷灰石磷酸三钙制作为复合体,可明显促进人牙髓干细胞骨向分化。     

3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

目的探讨3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。 方法分离SPF级雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,实验分为：对照组、浸提组、诱导组及浸提诱导组,MTT法检测对照组,浸提组的细胞增殖情况,对比分析各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性,对各组细胞诱导培养17天后进行茜素红染色,观察钙结节染色情况。 结果MTT结果显示,浸提组与对照组在不同时间点的OD值比较,差异无统计学意义（P>0.05）,ALP活性结果显示,不同时间点各组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;不同时间点浸提诱导组与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;诱导组在48 h及72 h与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色结果显示,对照组细胞无钙结节点,浸提组及诱导组镜下肉眼可明显观察到红色区域染色,镜下观察可见钙结节点,浸提诱导组所产生的钙结节点的数量、大小以及染色的颜色深度均明显优于其他各组。 结论3D打印胶原/羟基磷灰石支架具有生物相容性好,可促进BMSCs向成骨分化,对细胞毒性低等特点,适宜用作骨缺损的治疗。     

兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较

[目的]探讨丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外生物相容性，为组织工程寻找理想的载体材料。[方法]体外培养兔骨髓间充质干细胞分别于丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外复合培养，应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜，四唑盐比色试验（MTT法），观察材料上复合培养的细胞的生物学特性。[结果]兔骨髓间充质干细胞可以在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨良好的黏附、增殖和生长。两种材料相比较其相容性没有明显的差异。[结论]丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨均具有良好的生物相容性，可以作为组织工程理想的载体材料。     

新型聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨的细胞相容性

目的前期试验证实,当纳米羟基磷灰石含量为20%时的聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料能满足人体骨缺损修复的生物力学要求,尚需进一步的观察其细胞相容性,为临床应用提供参考数据。方法制备纳米羟基磷灰石含量为20%时的聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料,并提取浸提液。设立阴性对照组(含10%胎牛血清的DMEM完全培养基)、实验组(浸提液)、阳性对照组(质量浓度为0.64%的苯酚),用兔骨髓间充质干细胞与材料浸提液共培养的方式进行。观察兔骨髓间充质干细胞在培养3,5,7 d各时相点的细胞形态学变化,运用MTT比色法,测定上述各组兔骨髓间充质干细胞细胞培养3,5,7 d的相对增殖度,判断材料对细胞的毒性程度。结果随着时间的延长,3组细胞的吸光度值均明显增加(P<0.01)。实验组兔骨髓间充质干细胞相对增殖度在第3,5,7天分别为95.3%,96.8%和97.6%,参照国家标准聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料的细胞毒性为1级;实验组与阴性对照组比较差异不显著(P>0.05),阳性对照组与其他两组比较差异显著(P<0.05)。实验组细胞形态正常,呈梭形,贴壁生长良好。结论聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料细胞相容性良好,细胞毒性为1级,参照GB/T16886.5.2003标准属于安全范围。     

人骨髓间充质干细胞复合不同载体的体内成骨

目的：探讨冻干松质骨与羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞体内成骨的影响。方法：取人骨髓间充质干细胞,使其附着于冻干松质骨和羟基磷灰石,并植入裸鼠皮下。定期腹腔内注射四环素液。18只裸鼠分别在术后2、4、6周处死,取标本进行HE、甲苯胺蓝染色观察和四环素荧光观察。结果：2周时,可见到骨髓间充质干细胞贴附在细胞复合松质骨（MC）组的标本表面及较深部的骨小梁表面,而在细胞复合羟基磷灰石（MH）组,细胞仅贴附在标本的表面。4周时,MC组的贴附细胞呈规则排列的立方体形,而MH组的细胞为不规则的立方体,排列也比较紊乱。到6周时,仅MC组出现了类骨质和四环素荧光,在松质骨骨块的所有孔隙内都可见到来自宿主的纤维组织长入,而羟基磷灰石仅在邻近表面的孔隙内见到这种纤维组织。结论：作为间充质干细胞载体,目前冻干松质骨要优于羟基磷灰石。     

骨细胞Wnt/β-Catenin通过Notch信号促进BMSCs成骨分化

目的探讨骨细胞Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用及其分子机制。方法采用条件性基因敲出Cre/loxp技术制备特异性激活骨细胞Wnt/β-Catenin信号通路的小鼠;体外分离其和野生对照组小鼠的骨细胞,并分别与野生型小鼠骨髓间充质干细胞共培养;碱性磷酸酶(ALP)染色及活性定量、茜素红(Alizarin red)染色检测共培养早期成骨分化和晚期钙盐沉积;Real-Time PCR检测骨细胞Notch信号配体Jag1、Jag2、Dll1、Dll4及共培养后成骨分化特异标志物Runx2、ALP、Osteocalcin的mRNA表达水平。随后于共培养中加入Notch信号通路化学抑制剂DAPT(对照组加DMSO),再次行碱性磷酸酶(ALP)染色及活性定量和Real-Time PCR检测成骨分化特异标志物表达水平。结果 Wnt/β-Catenin激活的骨细胞其自身Jag1、Jag2、Dll4 mRNA表达较对照组骨细胞明显升高(P0.05),与BMSCs共培养后成骨转录因子Runx2,成骨分化特异标志物ALP、Osteocalcin mRNA的表达较野生型明显升高(P0.05),钙盐沉积增加。加入DAPT后,骨细胞Wnt激活组成骨转录因子Runx2、ALP、Osteocalcin mRNA的表达明显下降(P0.05)。结论骨细胞调控骨的代谢,激活其Wnt/β-Catenin信号通路将通过上调Notch信号而促进BMSCs的成骨分化。     

富集骨髓基质干细胞复合多孔β-磷酸三钙促进骨缺损修复的实验研究

目的 评估富集骨髓基质干细胞(BMSCs)复合β-磷酸三钙(β-TCP)在促进骨缺损修复中的作用. 方法 抽取12只崇明山羊骨髓血,用梯度离心法分别将其中的BMSCs富集、分离后与β-TCP复合.12只山羊双侧股骨内髁钻孔,制备骨缺损模型.所有山羊左侧股骨内髁缺损通过富集BMSCs/β-TCP进行局部填充治疗(实验组),其中10只羊右侧股骨内髁缺损以单纯β-TCP颗粒填充治疗(对照组),2只羊右侧股骨内髁缺损旷置(空白组),评价富集效率.术后16周处死取材,将所得标本进行影像学观察和形态学计量,实验组和对照组之间进行比较. 结果 BMSCs富集后有核细胞数和碱件磷酸酶染色呈阳性的细胞集落形成单位(CFUs/ALP+)数均有显著提高,差异有统计学意义(P<0.05).X线侧位片和μ-CT形态计量分析显示实验组新生骨长入率(70.27%±8.47%)显著高于对照组(21.40%±5.77%),差异有统计学意义(t=11.97,P<0.05).X线侧位片、CT平扫与三维重建以及μ-CT图像均可见实验组疗效优于对照组. 结论 在促进骨缺损修复中,富集BMSCs/β-TCP的疗效优于单纯β-TCP颗粒,有良好的应用前景.     

利用灌注式生物反应器体外构建大段组织工程化骨的实验研究

目的 研究体外利用灌注式生物反应器构建大段组织工程化骨的可行性. 方法把在体外培养扩增的第三代人骨髓基质干细胞与大段多孔β-磷酸三钙(β-TCP)支架复合.将细胞/支架复合体放入灌注式生物反应器中,进行连续灌注培养.28 d后,检测细胞的增殖及碱性磷酸酶(ALP)活性,同时对培养后的细胞/支架复合体进行组织学检测及形态学计量,用以评价体外组织工程化骨的构建.以静态培养作为对照组. 结果培养28 d后,灌注培养组的细胞活性明显高于静态培养组.灌注培养组细胞的ALP活性显著高于静态培养组.静态培养组细胞仅在多孔β-TCP支架周缘增殖,形成的新骨量较少.灌注培养组细胞在整个β-TCP支架内增殖,形成的新骨量较多. 结论利用灌注式生物反应器的灌注培养,可以使人骨髓基质干细胞在大段β-TCP载体内增殖并形成新骨,使体外大段组织工程化骨的构建成为可能.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

In Vivo Osteogenic Capability of Human Mesenchymal Cells Cultured on Hydroxyapatite and on β-Tricalcium Phosphate

The aim of the current study was to examine in vitro osteogenic capability and in vivo bone formation of mesenchymal stromal cells (MSCs) on two kinds of calcium phosphate ceramics. MSCs derived from human bone marrow were seeded on either hydroxyapatite (HA) ceramic or β-tricalcium phosphate (β-TCP) ceramic and then cultured in a medium supplemented with a donor's serum, vitamin C, β-glycerophosphate, and dexamethasone. The culture revealed the expression of alkaline phosphatase activity, indicating the osteogenic differentiation of the MSCs on the ceramics (fabrication of tissue-engineered construct). The constructs were then implanted subcutaneously into nude rats for 8 weeks. New bone formation was observed in both types of ceramics, and human-specific Alu sequence was detected by in situ hybridization analysis. Quantitative microcomputed tomography showed that the volume of the new bone in the HA ceramic was greater than that in the β-TCP ceramic in six of seven cases. These results suggest that human MSCs cultured on ceramics could retain their osteogenic capability even after ectopic implantation and provide a rationale for the use of tissue-engineered constructs derived from a patient's MSCs and calcium phosphate ceramics in bone tissue regeneration.     

新型骨组织工程β-TCP／CPPF／PLLA支架复合BMSCs修复节段性骨缺损的影像学研究

目的：将自体骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）接种到β-TCP／CPPF／PLLA支架上,进行体外复合培养,构建组织工程人工骨,植入兔桡骨大段骨缺损模型中,评估BMSCs／β-TCP／CPPF／PLLA复合体促进成骨的作用。方法：用新西兰大白兔40只,随机分为BMSCs／β-TCP／CPPF,PLL复合物组（A组）、β-TCP／CPPF／PLLA支架组（B组）、空白对照组（C组）共三组,建立兔桡骨双侧大段骨缺损模型,相应植入自体细胞材料复合物和单纯支架材料,空白对照组不作任何处理。术后4、8、12、16周处死动物,摄X线片观察骨缺损修复情况。结果：X线检查结果：A组术后2周可见缺损处有散在的、少量的模糊状骨痂生成,术后4周可见明显的骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较4周更加明显,部分髓腔已通,术后12～16周,缺损区已完全为新生的骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区比正常的桡骨较细。B组、C组术后2～16周,虽有不同程度的成骨现象,但没有完全修复骨缺损区,B组较C组修复明显。X线评分结果：A组在各时期均明显高于B组,差异具有显著性（P〈0．01）。结论：自体BMSCs与β-TCP／CPPF／PLLA复合物移植能修复大节段的骨干缺损。     

Repair of bone defect in caprine tibia using a laminated scaffold with bone marrow stromal cells loaded poly (L-lactic acid)/β-tricalcium phosphate

Repair of bone defects of a critical size encounters many problems, and many efforts aim to build a porous scaffold loading bone marrow stromal cells (BMSCs) or bone morphogenetic protein (BMP2) to quickly repair bone defects. In this paper, a laminated scaffold was designed and tested for the repair of bone defects in a caprine tibia. Beta-tricalcium phosphate (β-TCP) and poly (L-lactic acid) (PLLA) were fabricated to a sandwich structured composite that was then rolled up to form a cylindrical shaped, porous scaffold. The porosity and bending strength of the PLLA/β-TCP laminated scaffold were around 70% and 1.7 MPa, respectively. Results from in vitro experiments showed that the pH value of the scaffold in water fluctuated between 4.9 and 7.0 during its degradation. When exposed to the simulated body fluid, the scaffold lost its strength after 11 weeks of degradation. After implantation in Chinese caprines' diaphyseal defects with loaded allogeneic BMSCs, the scaffold sped up the bone repair without collapse of the scaffold and the unwanted inflammatory response, and then rapidly degraded and finally disappeared at 12 weeks. Gross examinations and pullout tests showed that the experimental caprines walked normally and the implanted leg could be heavily loaded. X-ray examinations and histological analyses showed new bone tissues formed with similar structures to normal ones. It is suggested that the novel PLLA/β-TCP laminated scaffold with BMSCs loading can regenerate new bones quickly.     

体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。