抑制细胞外信号调节激酶转导结直肠癌细胞组蛋白磷酸化和基因表达的影响

目的 观察人结直肠癌细胞中细胞外信号调节激酶-丝裂原激活蛋白激酶(ERK-MAPK)信号转导途径与组蛋白磷酸化水平及其相关蛋白表达的关系,及其对细胞增殖和细胞周期的影响.方法 培养结直肠癌细胞系SW1116、HCT116,以终浓度分别为0、10、20及40μmol/L的ERK-MAPK阻断剂U0126干预细胞.细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK-8)检测细胞活力影响,以流式细胞术(flow cytometry,FCM)研究细胞周期变化,Western免疫印迹法分析组蛋白H3激酶核糖体S6丝氨酸-苏氨酸激酶2(ribosomal S6 kinase 2,RSK-2)、丝裂原和应激-激活的激酶1和2(mitogen-and stress-activated kinase 1 and 2,MSK1和MSK2)、组蛋白H3(Ser10)磷酸化水平及c-Fos蛋白表达变化情况.结果 CCK-8法检测发现ERK-MAPK阻断剂能以剂量和时间依赖方式明显抑制2种结直肠癌细胞的增殖,增殖率可下降至对照组的47%;并能明显增加G0/G1期细胞百分比(P<0.01),而S期细胞百分比明显减少(P<0.01).Western印迹结果显示U0126干预后,H3激酶MSK1和RSK2表达明显降低,分别为对照HCT116的28%和40%,而MSK2蛋白水平在2个细胞系中均无明显变化.相应地,组蛋白H3磷酸化(Ser10)水平亦降低,相关蛋白c-Fos的表达亦明显下降.结论 抑制ERK-MAPK信号转导可能通过抑制组蛋白H3激酶MSK1、RSK2活性而降低组蛋白H3磷酸化水平,进而减少c-Fos蛋白表达,从而抑制人结直肠癌细胞的增殖和生长.     

RNA干扰CST1基因表达对结直肠癌细胞增殖侵袭及STAT3信号通路的影响

目的探讨RNA干扰CST1基因表达对结直肠癌细胞增殖、侵袭及信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响。方法 Western blotting法检测人结直肠癌SW480、HCT116、Caco2和HT29细胞及正常结肠NCM460细胞中CST1的蛋白表达。以Lipofectamine~(TM) 2000为载体,将设计合成的CST1的特异性siRNA及阴性对照siRNA转染HCT116细胞(si-CST1组和NC组),并设置空白对照组。转染48 h,MTT法检测细胞活力,Transwell小室检测穿膜细胞数,Western blotting法检测STAT3、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的蛋白表达。结果人结直肠癌SW480、HCT116、Caco2和HT29细胞中CST1蛋白的表达均显著高于正常结肠NCM460细胞(P0.05)。si-CST1组HCT116细胞中CST1蛋白的表达显著低于空白对照组(P0.05)。与NC组比较,si-CST1组细胞活力和侵袭能力显著降低,p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著降低(P0.05)。结论 RNA干扰CST1基因表达可抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭,其机制可能与下调STAT3信号通路有关。     

HDAC1对结直肠癌细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的研究组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对结直肠癌细胞凋亡及侵袭能力的影响。方法结直肠癌细胞Caco2中转染HDAC1 siRNA和siRNA control记为HDAC1 siRNA和siRNA-NC,以不做转染的细胞为Control。qRT-PCR、Western blotting检测细胞HDAC1 mRNA、HDAC1蛋白水平,流式细胞术测定细胞凋亡,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移,Western blotting测定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白水平。结果 siRNA-NC细胞HDAC1 mRNA、HDAC1蛋白、细胞凋亡率、细胞侵袭、迁移数目和MMP-2、MMP-9、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平与Control相比无明显变化(P0.05)。HDAC1 siRNA细胞HDAC1 mRNA、HDAC1蛋白明显降低,细胞凋亡率明显升高,细胞侵袭和迁移数目明显减少,细胞MMP-2、MMP-9蛋白水平表达下降,Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平升高,与Control相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HDAC1表达下调诱导结直肠癌细胞凋亡,抑制结直肠癌细胞侵袭及迁移,其作用机制与下调MMP-2、MMP-9和促进Bax、Cleaved caspase-3表达有关。     

长非编码RNA H19在结直肠癌化疗敏感性中的作用研究

目的研究长非编码RNA H19在结直肠癌化疗药物敏感性中作用。 方法分别构建lncRNA H19稳定过表达及表达沉默的结肠癌细胞株,分别加入5-FU培养,RT-qPCR检测H19表达,MTT法检测各组细胞增殖率,通过划痕实验检测各组迁移能力;Western blot检测各组细胞凋亡蛋白、耐药蛋白MDR1、MRP1和BCRP表达。 结果与正常细胞比较,lncRNA H19在结直肠癌细胞中表达升高,lncRNA H19稳定过表达组细胞增殖率明显高于H19表达沉默组,lncRNA H19稳定过表达组细胞48 h迁移距离明显大于H19表达沉默组,lncRNA H19稳定过表达组Bax蛋白表达下调,BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP表达上调,H19表达沉默组Bax蛋白表达上调,BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP表达下调。 结论lncRNA H19高表达的结直肠癌降低结直肠癌对化疗药物的敏感性,下调lncRNA H19表达可提高化疗药物的疗效。     

下调BAP31基因表达抑制结直肠癌细胞增殖侵袭及Wnt/β-catenin信号

目的探讨下调B细胞受体相关蛋白(BAP)31基因表达对结直肠癌细胞增殖侵袭及Wnt/β-catenin信号的影响。方法以正常结肠上皮细胞NCM460为对照细胞,Western印迹检测结直肠癌DLD-1,HT29,SW620和HCT116细胞中BAP31的蛋白表达。设计合成BAP31的特异性siRNA及阴性对照siRNA,分别命名为si-BAP31组和NC组,参照LipofectamineTM 2000说明转染HCT116细胞,仅加入脂质体的为空白对照组,Western印迹检测BAP31、β-catenin、增殖细胞核抗原(PCNA)和基质金属蛋白酶(MMP)-2的蛋白表达;细胞计数试剂盒(CCK)8检测细胞活力;Transwell小室检测穿膜细胞数。结果结直肠癌DLD-1,HT29,SW620和HCT116细胞中BAP31的表达均显著高于在NCM460细胞表达(P0.05)。转染si-BAP31的HCT116细胞BAP31表达明显受到抑制,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。与NC组比较,si-BAP31组在24、48和72 h的细胞活力显著降低,在48 h的细胞侵袭能力及β-catenin、PCNA和MMP-2的蛋白表达均显著降低(P0.05)。结论下调BAP31基因表达可抑制结直肠癌细胞增殖侵袭能力,机制可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

HDPR1对结直肠癌细胞迁徙和侵袭能力的影响

目的研究HDPR1在结直肠癌中的表达情况以及对直肠癌细胞迁徙和侵袭能力的影响。方法运用siRNA技术沉默结直肠癌细胞系HCT-116的HDPR1表达后,应用实时PCR检测HDPR1的表达变化,并应用transwell基质胶实验观察结直肠癌细胞的迁徙和侵袭能力变化。结果HDPR1在结直肠癌中的表达高于癌旁正常的黏膜组织。沉默结直肠癌癌细胞系HCT-116中的HDPR1表达后,HDPR1的表达明显下调,结直肠癌细胞的迁徙和侵袭能力明显增强。结论 HDPR1在结直肠癌细胞中的高表达可促进结直肠癌细胞的迁徙和侵袭能力。     

κ阿片受体激动通过钙调神经磷酸酶和胞外信号调节激酶信号抑制异丙肾上腺素诱导的乳鼠心肌肥大

目的探讨κ阿片受体(κ-OR)激动抑制异丙肾上腺素(Iso)诱导的乳鼠心肌细胞肥大的信号转导机制。方法利用体外培养模型,以Iso 10μmol/L诱导心肌细胞肥大,观察κ-OR激动剂U50488 H1μmol/L的作用,并进一步探索在钙调神经磷酸酶(CaN)特异性抑制剂环孢菌素A(CsA)、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂U0126、L型钙通道阻滞剂维拉帕米及β肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔存在的情况下,κ-OR的激活对心肌肥大的影响。Lowry法测心肌细胞蛋白含量;消化分离法及计算机图像分析系统测细胞体积;采用Till阳离子测定系统,以Fura-2/AM为荧光探针,观察胞内[Ca2+]i瞬间变化;Western blot法测CaN、ERK表达。结果U50488 H1μmol/L可以明显抑制Iso诱导的心肌蛋白含量增加、体积增大和胞内[Ca2+]i瞬间变化的增高,其抑制程度与CsA、U0126、维拉帕米及普萘洛尔相似;U50488 H可以抑制Iso诱导的CaN表达增加和ERK磷酸化增加;CaN抑制剂CsA可以抑制Iso诱导的ERK磷酸化增加,ERK抑制剂U0126可以抑制Iso诱导的CaN表达增加。结论κ-OR...     

Survivin基因沉默对结直肠癌PTTG mRNA的影响

目的探讨重组载体介导的Survivin小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌细胞株Lovo中PTTG mRNA的影响。方法前期成功构建的Survivin特异性siRNA真核表达载体转染结肠癌Lovo细胞后,采用实时荧光定量PCR检测PTTG mRNA的表达水平。结果 Survivin基因沉默后24～72 h,与正常对照组相比,Survivin mRNA表达明显降低(P<0.05);基因沉默24和48 h后,pGenesil-2-Survivin 1组和pGenesil-2-Survivin 2组PT-TG mRNA表达显著低于正常对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因沉默后结直肠癌细胞PTTG mRNA表达显著下调,提示Survivin和PTTG可能相互促进共同参与结直肠癌的发生发展。     

HSP27对雌激素诱导的内皮保护作用的影响

目的研究HDL通过1-磷酸鞘鞍醇受体途径上调COX-2表达的细胞内信号机制。方法培养人脐静脉内皮细胞,HDL不同时间和浓度处理,qPCR和WB检测COX-2、CREB和Sphk2表达情况。人脐静脉内皮细胞转染SiRNASphk2后,qPCR和WB检测HDL对COX-2表达情况。人脐静脉内皮细胞用采用JTE(抑制S1P2)、PTX(抑制Gi/o)、SB203580(抑制p38MAPK)、Stau-rosporine(抑制PKC)及U0126(抑制ERK1/2)抑制剂处理后,qPCR和WB检测HDL对COX-2的表达情况。免疫共沉淀检测p-CREB和Sphk2结合情况,用激光共聚焦进行定位观察。结果 HDL呈时间和剂量上调COX-2、SphK2表达及CREB磷酸化,转染SphK2siRNA后COX-2表达水平下调;采用JTE(抑制S1P2),SB203580(抑制P38MAPK),Staurosporine(抑制PKC),U0126(抑制ERK1/2)抑制剂处理后,HDL对COX-2的上调作用明显抑制;免疫共沉淀和激光共聚焦显示p-CREB和SphK2结合。结论 HDL通过S1P2-G i/o-PKC(P38MA...     

DNA甲基化酶抑制剂与雷帕霉素对人结直肠癌细胞周期及mTOR信号转导通路的联合作用

目的探讨5-氮脱氧胞苷（5-aza-dC）与雷帕霉素（RPM）对人结直肠癌细胞的联合作用及机制。方法应用MTT比色法检测5-aza-dC与RPM对3种人结直肠癌细胞株的生长抑制作用；应用流式细胞术检测两者对细胞周期的调控；应用免疫印迹法检测两者对于mTOR信号转导通路相关蛋白的影响。结果5-aza-dC与RPM对人结直肠癌细胞株SW480、HT29和HCT116均有生长抑制作用，在相同作用条件下，5-aza-dC与RPM的联合抑制效果明显优于两者单独用药。5-aza-dC与RPM单独或联合用药对3种细胞的生长周期均具有调控作用（P〈0．05），但作用位点不尽相同。5-aza-dC与RPM可下调mTOR、p70s6K、4E—BP1蛋白的磷酸化水平，对蛋白的总体水平无明显影响，以两者的联合作用最为显著。结论5-aza-dC与RPM可联合抑制人结直肠癌细胞株SW480、HT29和HCT116的生长，并阻滞其细胞周期进程。其作用机制可能与影响mTOR信号转导通路蛋白磷酸化水平有关。     

巨噬细胞游走抑制因子通过PI3K／Akt信号通路调控人结肠癌细胞株HT-29增殖和血管生成因子表达

背景：巨噬细胞游走抑制因子（MIF）是-种多功能细胞因子,其在结直肠癌发生、发展中的作用机制尚不明确。目的：探讨MIF是否通过P13K／Akt信号通路调控人结肠癌细胞增殖和血管生成因子表达。方法：人结肠癌细胞株HT-29分为对照组（RPMI-1640）、重组人MIF（rhMIF）组、PI3K抑制剂LY294002组和LY294002预处理联合rhMIF组,并予相应干预。以甲基噻唑基四唑（MTT）法检测HT-29细胞增殖状态,分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素-8（IL-8）mRNA表达和蛋白分泌,蛋白质印迹法检测Akt和磷酸化Akt（p—Akt）蛋白表达。结果：rhMIF对HT-29细胞具有促增殖作用,能增加细胞VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白分泌,并促进Akt蛋白磷酸化（P＜0．05）;而先予LY294002预处理可显著抑制rhMIF的上述作用．HT-29细胞增殖显著受抑（P＜0．05）,VEGF、IL-8mRNA表达、蛋白分泌以及p-Akt蛋白水平与对照组相比无明显差异。各组总Akt蛋白水平均无明显差异。结论：MIF诱导人结肠癌细胞增殖和血管生成因子表达可能是通过活化PI3K／Akt信号通路实现的。     

丝裂原激活蛋白激酶阻断剂与DNA甲基化酶抑制剂对人结肠癌细胞的协同影响

目的研究细胞外信号渊节激酶-丝裂原激活蛋白激酶途径（ERKMAPK）与DNA甲基化问的关系及对结肠癌细胞生物学行为的协同影响。方法培养人结肠癌细胞SW1116，分别以PBS、二甲基亚砜（DMSO）为对照组，PD 9805950μmol／L、5氮脱氧胞苷（5-aza—dC）5μmol／L、PD9805950μmol／L＋5-aza-dC5μmol／L进行药物干预．以定量RT-PCR检测DNA甲基化酶（Dnmt）1、3a和3b基因转录水平；流式细胞仪分析细胞周期；MTT测定细胞活力；光学显微镜下观察细胞形态学变化。结果ERK—MAPK途径阻断剂PD98059下调Dnmt 1和Dnmt 3b．Dnmt抑制剂5-aza-dC下调Dnmt 1、Dnmt 3a和Dnmt 3b，且5-aza-dC联合PD98059对Dnmt1及Dnmt 3a mRNA的表达下调更为显著。5-azo-dC明显降低G0／G1期细胞百分比（P〈0．05），G2／M期细胞百分比明显增加（P〈0．05）；PD98059使G0／G1期细胞百分比降低（P（0．05）．G2／M期增加（P〈0．05）。PD98059明显抑制细胞生长。PD98059促进细胞分化，呈上皮样改变，细胞变狭长，胞质减少，细胞排列开始出现相对整齐；5-azm-dC干预组细胞大小不一，出现较多多倍体细胞（多个核分裂相）。结论ERK-MAPK途径阻断剂及Dnmt抑制剂均能抑制结肠癌SW1116细胞分裂、增殖，并诱导细胞分化；两者有协同作用；ERK—MAPK信号转导途径能调控DNA甲基化水平。     

IL-17A在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响~

背景:白细胞介素-17A(IL-17A)在炎症反应中发挥重要作用。既往研究发现IL-17A基因多态性与某些亚型胃癌的发生风险增加有关。目的:探讨IL-17A在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响。方法:以免疫组化法和RT-PCR法分别检测胃癌组织、相应癌旁非癌组织以及胃癌细胞株的IL-17A表达。以不同浓度重组人IL-17A处理胃癌细胞株SGC7901,以MTT法检测细胞增殖,以流式细胞术检测细胞凋亡,以real-time RT-PCR检测细胞中的IL-6、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)mRNA表达。结果:胃癌组织中IL-17A阳性细胞数较相应癌旁非癌组织显著增多(P0.05),且主要表达于炎性细胞和血管内皮细胞,在胃癌细胞株中无表达。重组人IL-17A可刺激SGC7901细胞增殖,抑制H_2O_2诱导的细胞凋亡,并上调其IL-6、MMP-13 mRNA表达。结论:IL-17A可直接或通过诱导炎症信号通路分子间接促进胃癌进展。     

CKS2在结直肠癌中的表达和临床意义

背景：细胞周期蛋白依赖性激酶亚基（CKS）家族在细胞周期调节中起重要作用。研究发现其家族成员CKS2在一些恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的高侵袭性行为和预后不良相关。目前关于CKS2与结直肠癌关系的文献报道较罕见。目的：研究CKS2在结直肠癌中的表达和临床意义。方法：应用realtimeliT—PCR和蛋白质印迹法检测23例临床结直肠癌手术标本癌组织、癌旁非癌组织和正常组织中的CKS2mRNA和蛋白表达。结果：CKS2mRNA和蛋白在结直肠组织中的相对表达量依次为：癌组织〉癌旁组织〉正常组织,癌组织与正常组织问差异有统计学意义（P〈0．01）。性别对CKS2mRNA在不同结直肠组织中的表达趋势无明显影响。癌组织中的CKS2蛋白表达与肿瘤大小和pTNM分期呈正相关（P〈0．01）,与肿瘤部位无关。结论：CKS2蛋白在结直肠癌中呈高表达并与肿瘤临床病理特征相关,有望成为结直肠癌新的分子标记物和治疗靶点。     

曲古霉素A对人胃癌细胞的抑制作用及其机制探讨

背景：组蛋白去乙酰基酶抑制剂（HDACi）是一类新型抗肿瘤药物。曲古霉素A（TSA）是目前研究最为广泛的HDACi之一,已发现其对多种肿瘤细胞具有明显抑制作用,但关于TSA对胃癌作用的研究尚少。目的：观察TSA对人胃癌细胞增殖、凋亡、细胞周期以及相关基因表达的影响,探讨其抑制人胃癌细胞的可能作用机制。方法：以不同浓度TSA（0—1μmol／L）处理人胃癌细胞株AGS和HGC-27。CCK-8实验检测细胞增殖抑制情况,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,realtimeRT-PCR和蛋白质印迹法检测细胞凋亡、细胞周期相关基因mRNA和蛋白水平的表达。结果：TSA能剂量依赖性地抑制AGS、HGC-27细胞增殖（P=0．000）,对两者的半数致死浓度分别约为0．25μmol／L和0．5μmol／L。TSA能诱导AGS、HGC-27细胞发生G0／G1期和G2／M期阻滞,以G0／G11期阻滞更为明显。TSA对AGS细胞的诱导凋亡作用强于HGC-27细胞（P〈0．05）。TSA尚能上调p21、p53、BaxmRNA和蛋白表达,下调Bel-2、CDK2、cyelinD1mRNA和蛋白表达,作用均呈时间依赖性（P〈0．05）。结论：TSA抑制人胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能是通过调节细胞凋亡、细胞周期相关分子、激活多种肿瘤相关信号通路实现的。     

氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响

背景：氧化苦参碱为中药苦参的主要有效成分，研究显示其对结肠癌细胞具有杀伤作用。目的：观察氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响，阐明其抗结肠癌作用的分子机制。方法：分别以2、3、4mg／m1氧化苦参碱干预SW1116细胞24h或48h，以流式细胞仪检测细胞周期，以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白（cyclin）D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、CDK抑制剂p53、核转录岗子E2F1和S期激酶相关蛋白2（Skp2）mRNA和蛋白水平的表达。结果：氧化苦参碱干预可使SW1116细胞周期阻滞于G0／G1期，cyc1inD1、CDK4、E2F1和Skp2mRNA和蛋白表达显著下降，p53mRNA和蛋白表达显著上升，作用呈剂量和时间依赖性（P〈0．05）。结论：氧化苦参碱可通过影响细胞周期相关通路以抑制人结肠癌细胞增殖。     

稳定转染15-PGDH基因对人胃癌细胞生长和迁移的影响

背景：前期研究表明胃癌组织中NAD＋依赖性15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）表达明显减低,瞬时转染15-PGDH对人胃癌细胞的生长和迁移有一定抑制作用。目的：建立稳定转染15-PGDH基因的人胃癌细胞株SGC7901．观察恢复15-PGDH表达对胃癌细胞生长和迁移的影响,探讨15-PGDH与胃癌发生、发展的关系。方法：以双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒pcDNA3／15-PGDH,采用脂质体法将质粒转染人SGC7901细胞,G418筛选稳定转染株．实时聚合酶链反应（PCR）和蛋白质印迹法鉴定。分别以甲基噻唑基四唑（MTT）实验和细胞划痕实验检测稳定转染15-PGDH基因的SGC7901细胞株的增殖情况和迁移能力。结果：经4周G418筛选以及实时PCR和蛋白质印迹法鉴定,得到4株可稳定、较高水平表达15-PGDH的SGC7901细胞株。稳定转染15-PGDH基因的SGC7901细胞株．细胞生长和迁移能力显著低于空质粒组（P〈0．01）。结论：成功建立了稳定转染15-PGDH基因的SGC7901细胞株．恢复15-PGDH表达可显著抑制人胃癌细胞的生长和迁移。15-PGDH表达减低或缺失与胃癌的发生、发展密切相关。