转染血管内皮生长因子基因的小鼠NIH3T3细胞移植促进皮瓣早期血运重建的研究

目的探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因的小鼠NIH3T3细胞移植对缺血皮瓣的血管新生和皮瓣存活率的影响。方法体外PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染小鼠NIH3T3细胞,免疫组化方法检测小鼠NIH3T3细胞体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记小鼠NIH3T3细胞。将小鼠随机分为3组：A组[PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的NIH3T3细胞移植]、B组（单纯NIH3T3细胞移植）、C组（单纯DMEM培养基注射）。每只小鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后酶联免疫吸附（ELISA）法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起一个蒂在尾侧的4．0cm×1．5cm的随意皮瓣。术后第7天分别观察皮瓣的存活率、血流灌注、皮瓣毛细血管密度、NIH3T3细胞在皮瓣内的分布和存活情况。结果转染VEGF165基因的小鼠NIH3T3细胞体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A组的皮瓣存活率、毛细血管密度、血流灌注比值均显著高于另外两组（P〈0．05）。结论转染VEGF基因的小鼠NIH3T3细胞皮下移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

bcl-2及其重要功能结构域在调节成纤维细胞NIH3T3凋亡中的研究

目的 以成纤维细胞NIH3tT13作为细胞模型,探讨bel-2 Loop Domain结构域在成纤维细胞凋亡中的作用地位.方法 构建正常和Loop Domain结构域突变bcl-2基因的真核表达质粒,用于成纤维细胞转染;脂质体介导,分别将(1)空载体质粒(2)携带bcl-2基因质粒和携带突变基因的质粒转染成纤维细胞(NIH3T3),转染后用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激NIH3T3细胞诱导凋亡,应用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞凋亡,应用华联小鼠全基因表达谱芯片检测各组细胞基因表达谱的变化.结果 成功构建bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体;成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞;各组转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡,FCM检测发现,TNF-α刺激细胞17 h后,NIH3T3未转染细胞凋亡明显增加,细胞凋亡率为(53.18 ±8.18)%,NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率明显下调;NIH3T3转染突变bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3转染突变bcl-2质粒组比较细胞凋亡率明显上调;基因芯片检测发现:转染bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因与转染空质粒组下调,转染Loopdomain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因比转染bcl-2基因的NIH3T3细胞上调.结论 证实bcl-2基因Loop domain结构域突变对bcl-2基因功能产生明显影响,bcl-2基因Loop domain结构域突变使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化.     

黏附分子T-cadherin表达对胶质母细胞瘤C6细胞的生抑制作用

目的 探讨T—cadherin分子表达对胶质母细胞瘤C6细胞增殖的影响。方法 利用脂质体将pcDNA3和pcDNA3．T—cadherin表达质粒转染C6细胞，以克隆形成试验和细胞增殖试验研究T-cadherin表达对C6细咆增殖的影响。结果 转pcDNA3．T-cadherin质粒的C6细胞形成的细胞克隆数显著少于转染pcDNA3载体质粒的C6细胞形成的克隆数，两者差异有统计学意义（P〈0．01）。转染后表达T—cadherin分子C6细胞的生长速度明显慢于转染空载体不表达T—cadherin的C6克隆（P〈0．01），且T—cadherin表达水平与C6细胞增殖速度呈负要关。结论 T—cadherin分子表达显著抑制胶质母细胞瘤C6细胞的增殖。     

黏附分子T-cadherin表达诱导C6胶质母细胞瘤细胞G2期阻滞

目的 研究T-cadherin分子表达抑制胶质母细胞瘤C6细胞增殖的机制。方法 利用脂质体转染pcDNA3和pcDNA3-T-cadherin质粒后获得的表达和不表达T-cadherin的C6细胞克隆，以流式细胞仪检测两种克隆细胞的细胞周期的变化，同时分析其细胞周期与细胞分裂指数的关系。结果 转染后表达T-cadherin的C6细胞在去血清培养48h使细胞周期同步后，分别用血清刺激培养12h后行流式细胞仪检测，与转染空载体的1、2克隆相比，转染T-cadherin基因后表达T-cadherin的3、4克隆于G2／M期的细胞比例显著增加（3、4克隆为52．60％和51．84％，1、2克隆为16．17％和13．47％），而G1期的细胞比例显著下降（3、4克隆为0．66％和0．39％，1、2克隆为50．6％和57．9％）。在血清刺激0、4、8、12、24和48h时，空载体克隆1在各时间点的分裂指数与其G2／M期的细胞比例一致，而表达T．cadherin的克隆3在各时间点的分裂指数显著低于其G2／M期的细胞比例数。结论 T．cadherin分子表达能诱导C6细胞G2期细胞阻滞，该机制可能是T-cadherin抑制C6细胞增殖的主要机制。     

血管内皮生长因子调节小鼠系膜细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制物的表达

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养的小鼠系膜细胞表达基质金属蛋白酶（MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs)的调节作用。方法：对体外培养的小鼠系膜细胞应用人重组VEGF孵育12h，应用蛋白质印迹法检测细胞培养液MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2的蛋白质水平；应用白明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的活性；应用RT－PCR检测系膜细胞TIMP1、TIMP2 mRNA表达。结果：VEGF（10ng/ml)可提高小鼠系膜细胞MMP2和MMP9蛋白质释放（和对照组相比分别提高43％和34％，P＜0．05），MMP2和MMP9活性分别提高17％和26％（P＜0．05）。同时，VEGF可呈剂量依赖地下调小鼠系膜细胞TIMP1和TIMP2蛋白质和mRNA的表达，VEGF（25ng/ml)可减少小鼠系膜细胞TIMP1和TIMP2蛋白质释放分别为43％和67％（P＜0．05）；并抑制TIMP1和TIMP2 mRNA的表达（分别下降41％和59％，P＜0．01）。结论：VEGF使系膜细胞MMPs蛋白质表达增加、活性增强，同时下调TIMPs mRNA和蛋白质的表达，可能在增生性肾小球肾炎的发病机制中起一定的作用。     

构建人CD59真核表达载体并利用壳聚糖介导转染NIH3T3细胞

目的构建人CD59真核表达载体pSecTag2／HygroB-CD59，并利用壳聚糖（chitosan）组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NIH3T3细胞。方法应用PCR方法，从CD59-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-CD59真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定。利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH3T3细胞，并用抗CD59抗体对转染细胞进行免疫组织化学染色。结果CD59基因大小为312bp，与Genbank中记载的人CD59cDNA序列结果完全一致。利用壳聚糖-CD59纳米微粒转染NIH3T3细胞24h后，免疫组织化学染色显示转染细胞CD59呈弥漫性胞浆阳性。结论成功构建了人CD59真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

基质金属蛋白酶(MMP)9、MMP2 mRNA及基质金属蛋白酶抑制剂2 mRNA在人膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的探讨膀胱移行细胞癌中基质金属蛋白酶（MMP）9、MMP2及基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）mRNA表达与膀胱肿瘤恶性程度和侵袭性之间的关系及其临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测36例膀胱移行细胞癌及5例正常膀胱组织MMP9、MMP2、TIMP2mRNA的表达。结果MMP9、MMP2mRNA随着肿瘤分级分期的增高，表达明显增强[x^-值（MMP9）G1：1．218，G2：1．681，G3：1．811；T2～T4：1．840，Tis～T1：1．399；P〈0．01；（MMP2）G1：1．323，G2：1．694，G3：2．060；T2～T4：1．950，Tis-T1：1．505；P〈0．01]，且明显高于正常膀胱组织中的表达[互值（MMP9）0．455，（MMP2）0．461；P〈0．01]。TIMP2mRNA随肿瘤分级的增高而明显减少（x^-值：G1：1．489，G2：1．391，G3；0．580；P〈0．01）。结论（1）MMP9、MMP2mRNA的高表达与BTCC的恶性程度呈正相关；（2）TIMP2mRNA的表达与BTCC的恶性程度呈负相关。     

基质金属蛋白酶9、3和金属蛋白酶组织抑制物1在原发性膜性肾病肾小球内的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）和金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）在原发性膜性肾病（IMN）患者肾小球内的表达变化及其与蛋白尿、Scr的关系。方法用免疫组织化学技术分别检测44例IMN患者（IMN组）与6例正常对照者（对照组）肾小球内MMP-9、MMP-3和TIMP-1的表达。结果MMP-9及MMP-3在对照组正常肾组织的肾小管上皮细胞、肾间质和肾小球足细胞有少量表达；在IMN组肾小球足细胞、系膜细胞、肾小球基底膜及肾小管上皮细胞有表达。IMN组肾小球内MMP-9及MMP-3的表达均较对照组显著增强（P〈0．05）。TIMP-1在对照组正常肾组织的肾小管上皮细胞有少量表达，肾小球内无表达；在IMN组肾小球足细胞、肾小管上皮细胞有表达。IMN组肾小球内TIMP-1的表达较对照组显著增强（P〈0．01）。IMN组24h尿蛋白定量显著高于对照组（P〈0．01）。Ⅱ期MN组肾小球MMP-9／TIMP-1及MMP-3／TIMP-1比值较Ⅰ期MN组明显下降（P〈0．01）。IMN组肾小球内MMP-9的表达与Scr呈负相关（r=-0．02，P〈0．05）；TIMP-1的表达与Scr呈正相关（r=0．34，P〈0．05）。结论MMP-9与TIMP-1从正反两方面影响IMN患者肾功能的改变。MMP-9、MMP-3的异常表达与IMN患者蛋白尿之间可能相关；IMN患者肾小球MMP／TIMP比值失衡可能与IMN患者肾小球基底膜增厚相关。     

TENOMODULIN基因转染对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用

目的研究过表达Tenomodulin(TNMD)对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用。方法体外培养NIH3T3和C3H10T1/2细胞系,利用脂质体法在两种细胞系中分别转染pCAGGS空载体和pCAGGS-TNMD表达载体,G418进行稳定筛选。RT-PCR确认成功转染后,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,同时定量PCR检测肌腱相关基因的表达情况。结果两种细胞系转染后细胞形态均无明显改变。基因水平上,NIH3T3细胞过表达TNMD后,collagenⅥ和biglycan显著降低,collagenⅠ没有显著差别。而在C3H10T1/2细胞中,collagenⅠ和biglycan显著升高,collagenⅥ没有显著差别。结论过表达TNMD对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系的细胞形态没有影响,但能影响肌腱相关基因的表达情况。     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

荧光蛋白表达对小鼠成纤维细胞系NIH3T3体外增殖能力的影响

目的观察不同荧光蛋白表达对体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3增殖能力的影响,为细胞示踪技术提供理论依据。方法将体外扩增培养的NIH3T3细胞随机分为对照组、pLEGFP-N1组、pEGFP-N1组、pDsRed2-C1组。对照组不作任何处理,其他3组分别采用逆转录病毒载体pLEGFP-N1和真核表达载体pEGFP-N1、pDsRed2-C1两种转染方式进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)标记,经G418筛选培养后,观察各组细胞荧光蛋白表达情况,并计算其阳性表达率;观察各组细胞贴壁率,绘制生长曲线并测定倍增时间。结果对照组NIH3T3细胞未见荧光蛋白表达;pLEGFP-N1、pEGFP-N1组均表达EFGP,pDsRed2-C1组表达RFP,而pLEGFP-N1组阳性表达率高于另外两组(P<0.01).各组细胞均有较高的贴壁率。pEGFP-N1组细胞倍增时间为(39.6±0.6)h,pDsRed2-C1组(40.3±0.7)h,pLEGFP-N1组(36.5±0.7)h,均明显晚于对照组(27.9±0.6)h(P<0.01).结论荧光蛋白表达对NIH3T3细胞体外增殖有一定程度的影响,但逆转录病毒载体抑制作用低于普通真核表达载体,可作为细胞移植时荧光蛋白标记的较好选择。     

内皮抑素质粒联合阿霉素对人脑胶质肉瘤GL15细胞株增殖和凋亡的影响

目的 探讨内皮抑素(ES)以及ES和阿霉素联合应用对人脑胶质肉瘤细胞株GL15增殖和凋亡的影响.方法 通过质粒转染的方法,运用MTT法和流式细胞仪检测了ES以及ES和阿霉素联合应用对GL15细胞株增殖和凋亡的影响.结果 MTT法检测表明阿霉素对转染pcDNA3.1 ES的GL15细胞的生长抑制作用明显增强,细胞增殖明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测表明,转染pcDNA3.1 ES后,G0/G1期细胞明显增加(P<0.05),S期细胞明显减少(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01);联合阿霉素治疗后,上述差异更加显著(P<0.01).结论 ES联合ADM可明显抑制人脑胶质肉瘤GL15细胞株的生长,二者联用可以产生协同抗瘤作用.     

S期激酶相关蛋白2调控大鼠系膜细胞增殖

目的 探讨S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达变化对系膜细胞增殖的影响。 方法 设计合成大鼠Skp2 siRNA和对照siRNA、pIRES-GFP-Skp2质粒和pIRES-GFP质粒。采用脂质体转染法进行细胞转染。半定量PCR和Western印迹法检测Skp2的mRNA、蛋白表达。原代培养的大鼠系膜细胞以每孔3000个接种于96孔板,分为以下6组：（1）无血清组;（2）20％胎牛血清（FCS）组;（3）10％FCS+pIRES-GFP质粒转染组;（4）10％FCS+pIRES-GFP-Skp2质粒转染组;（5）20％FCS+对照siRNA组;（6）20％FCS+Skp2 siRNA组。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞相对活力和相对细胞数;BrdU标记法检测S期细胞;流式细胞仪检测细胞周期。 结果 半定量PCR法结果显示,与阴性对照siRNA组相比,Skp2 siRNA转染后Skp2 mRNA表达显著下调。Western印迹结果显示,与pIRES-GFP质粒转染组相比,pIRES-GFP-Skp2质粒转染后Skp2蛋白表达显著上调。MTT、BrdU和细胞周期分析显示,与相应对照组相比,Skp2质粒转染后相对细胞数增加（A值：0.419±0.088 比 0.305±0.036,P ＜ 0.01）、S期细胞数增多（BrdU 阳性细胞：0.21±0.04比0.15±0.03,P ＜ 0.01;S期细胞数：20.18±0.64比14.33±0.37,P ＜ 0.01）;Skp2 siRNA转染后相对细胞数减少（A值：0.328±0.069比0.482±0.133,P ＜ 0.01）;S期细胞数减少（BrdU 阳性细胞：0.17±0.01比0.24±0.00,P ＜ 0.01;S期细胞数：16.52±0.75比23.81±1.25,P ＜ 0.01）。 结论 Skp2过表达促进系膜细胞增殖,下调Skp2表达可抑制系膜细胞增殖。     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

hTGFβ1基因转染对NIH 3T3成纤维细胞增殖的影响

OBJECTIVE: To investigate the influence of hTGFbeta(1) ene transfection on the proliferation of in vitro cultured NIH 3T3 fibroblast. METHODS: Lipofictin mediated co-transfected method was employed to transfect hTGFbeta(1) plasmid DNA into NIH 3T3 fibroblasts of the rats. Cell growth counting method, MTT, flow cytometry (FCM) and soft agar clone forming method were adopted to examine the biology of the transfected cells. RESULTS: (1) Fibroblast growth slowed down after hTGFbeta(1) transfection, especially on 4th to 6th days after the transfection, which was accompanied by decreased synthesis of DNA as indicated by the increase of G(1) phase percentage (from 39.9% to 66.2% P < 0.05) and the decrease of S phase percentage (from 40.2% to 26.8%, P < 0.05); (2) There was no evident change of all the phases in a cell cycle in the blank load transfection group and in control group. (3) There was a good correlation between MTT and cell counting method (co-efficient 0.992) (4) The formation rate of the soft agar clone of fibroblast decreased from 1.18% to 0.55% (P < 0.05) after hTGFbeta(1) transfection. CONCLUSION: hTGFbeta(1) gene transfection could inhibit fibroblast proliferation, which might be related to the interference of TGFbeta(1) with the DNA synthesis of fibroblasts.     

人工合成小分子RNA对前列腺癌细胞周期及增殖的影响

目的 研究人工合成的dsP21-555对前列腺癌细胞株PC-3和LNCaP细胞周期和增殖的影响。方法 合成dsP21-555（实验组）和dsControl（阴性对照组）,分别转染至PC-3和LNCaP。使用Real-time PCR及Western blotting分别检测分析前列腺癌细胞转染后的p21mRNA及p21蛋白的表达情况。流式细胞术检测细胞周期分布,使用MTT实验及集落形成实验检测细胞的活力及增殖能力。结果 转染dsP21-555后PC-3和LNCaP细胞中的p21 mRNA水平分别上调至2.90倍(P<0.01)和2.05倍(P<0.01)。Western blotting实验结果符合这一趋势。流式细胞术检测显示,转染dsP21-555后,在S期和G2/M期的细胞比例下降,在G0/G1期的细胞比例则增加。MTT实验显示,与dsControl组相比,转染dsP21-555后,PC-3和LNCaP细胞的活力明显降低。集落形成实验显示,dsP21-555组的集落的数量较少,细胞增殖能力降低。结论 人工合成的dsP21-555能明显激活前列腺癌细胞中p21基因的表达,并显著抑制前列腺癌细胞周期的进展和增殖。     

Effect of cysteine-rich protein 61 on proliferation and cell cycle in human renal tubular epithelial cells

Objective To investigate the effect of cysteine-rich protein 61 (Cyr61) on proliferation and cell cycle in human renal tubular epithelial cells (HK-2). Methods Cyr61 cDNA was cloned into pEGFP-N2, then HK-2 cells were transfected with the recombinant plasmid pEGFP-N2-Cyr61 by Lipofectamine. The cell proliferation was measured by MTT. The expression level of Cyr61, p-FAK and cyclin dependent cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) protein were detected by Western blotting. The cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. Results The recombinant plasmid pEGFP-N2-Cyr61 could be transfected into HK-2 efficiently. After transfection, the proliferative activity was significantly increased, the proportion of HK-2 cells in G1 phase decreased and in S-phase increased significantly, the level of cell apoptosis decreased markedly (all P＜0.01). The expressions of Cyr61, p-FAK and CDK2 in Cyr61-transfected group were all amplified significantly (all P＜0.01). Conclusions Cyr61 protein over-expressed in HK-2 cells can increase CDK2 expression throngh FAK pathway, resulting in the promotion of HK-2 cells entering into S phase, cell proliferation and the reduction of cell apoptosis.     

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl(hSav1)蛋白对人胚肾293(HEK293)细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝(MTT)比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%;转染后36 h加入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU),通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为(27.3±3.8)%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为(12.9±5.3)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.     

pcDNA3.0-CBP真核表达质粒的构建及对肺腺癌SPC-A1细胞的影响

目的 观察外源性CBP基因稳定转染对人肺腺癌SPC-A1细胞体外生长的影响.方法 构建CBP真核表达质粒pcDNA 3.0-CBP,应用pcDNA 3.0-CBP和空载体质粒pcDNA3.0(-),脂质体转染法转染体外培养的人肺腺癌细胞株SPC-A1,G418(800mg/L)筛选出抗性克隆.Western blot检测转染前后CBP蛋白水平变化,噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长抑制作用,Transwell体外侵袭实验和Wound-healing实验对细胞进行侵袭和迁移能力研究.结果 转染CBP基因的细胞株有目的 基因整合和相应蛋白高表达.MTT检测pcDNA 3.0-CBP转染组活细胞吸光度(0.2787±0.0786)低于未转染组(0.5089±0.1301)和pcDNA 3.0(-)空载体转染组(0.4804±0.1547).pcDNA 3.0-CBP转染组与两对照组吸光度的差异有统计学意义(P<0.01).细胞侵袭实验表明pcDNA 3.0-CBP转染组穿透滤膜数(3.52±0.77)明显少于未转染组(8.17±0.86)和空载体转染组(8.22±1.30),转染组与两对照组侵袭力的差异有统计学意义(P<0.01).细胞迁移实验转染组细胞迁移数(71.30±7.68)明显少于未转染组(119.40±8.38)和空载体转染组(111.41±12.56),转染组与两对照组迁移力的差异有统计学意义(P<0.01).结论 外源性CBP基因稳定转染可抑制人肺腺癌SPC-A1细胞的恶性表型,可能通过对Src家族激酶(SFKs)的负反馈调节抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭.     

靶向沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响. 方法 将靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA Notch1-1转染膀胱癌细胞株T24和BIU-87,噻唑盐法、流式细胞术检测沉默Notch1后膀胱癌细胞生长、细胞周期和凋亡情况.RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后Notch1基因mRNA和蛋白表达的变化. 结果 转染后72 h,T24和BIU-87细胞G0/G1期细胞比例明显增加,分别为(80.13±2.69)%和(69.44±2.41)%,与T24对照组(23.89±1.32)%和BIU-87对照组(24.63±1.68)%比较差异有统计学意义(P值均<0.05).转染后72 h,T24和BIU-87细胞凋亡率分别为(13.75±1.23)%和(8.72±1.01)%,与T24对照组(1.28±0.14)%和BIU-87对照组(1.01±0.27)%比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).转染后24 h细胞生长明显受到抑制,该抑制作用持续到转染后96 h.转染后72 h,T24和BIU-87细胞中Notch1基因mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05). 结论 Notch1在膀胱癌细胞株中可能起致癌作用.沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖.