商丘市、济源市腹泻患者、家禽、家畜粪便中E.coli O157:H7的鉴定

目的：对商丘市、济源市腹泻患者、家禽、家畜粪便中首次分离的E.coliO157:H7进行生物学特性等方面的研究。方法：采集疫区患者，外环境，家畜和家禽粪便标本1895份，采用mEC肉汤增菌，胶体金免疫卡快速测定法，免疫磁珠集菌法，CHROMAGAR-O157：H7菌株，在CHROMAGAR-O157：H7显色培养基生长形态，颜色，生化反应出现多样化，rfbO157,stx2,hlyA,eaeA基因检测均阳性的有58株，stx2阳性1株，eaeA阳性4株，72株无毒力基因。结论：为本省实验室诊断E.coliO157:H7提供了理论依据；不同种类的家禽，家畜分离的产毒菌株比例差别显著，以波尔山羊最为突出；为今后在制定对该菌的诊断标准，传染源的追踪和控制及细菌毒力学等方面的研究提供了重要线索。     

WONCA研究论文摘要汇编(六十六)——2011年德国爆发的溶血性尿毒综合征与大肠杆菌菌株特性相关:微生物学研究

背景 2011年德国爆发由剧毒大肠杆菌0104:H4菌株导致的溶血性尿毒综合征及出血性腹泻(其他地方,如欧洲及北美洲也发现了病例)。2011年5月以来,此综合征发生810例,死亡39例。我们分析了引起本次爆发的实验室还原分离株的致病特性及相关表型。方法我们对2011年5月23日—6月2日向国家资质实验室呈交的80例病人的大便标本进行了分析。筛检分离株,采用标准PCR筛检分离株产志贺毒性大肠杆菌的致病基因,采用新研制多重PCR筛检爆发菌株(rfbO104,fliCH4,stx2及terD)的特异性。采用PCR检测产志贺毒素大肠杆菌以及其他肠内致病大肠杆菌典型的致病基因,用以确定分离株的致病特性。我们采用Shiga测序法对stx排序,检测了志贺毒素生成、上皮细胞黏附性、并确定了种系发生及抗菌敏感性。发现所有分离株均为HUSEC041克隆株(序列型678)。这种菌株具有产志贺毒素大肠杆菌(stx2,iha,lpfO26,lpfO113)和肠聚集性大肠杆菌(aggA,aggR,set1,pic,aap)结合致病特性,也包括志贺毒素2和上皮细胞聚集黏附性。分离株呈现出HUSEC041缺乏的超广谱β-内酰胺酶表型。解释由...     

什么是O157∶H7?

O15 7∶H7是肠出血性大肠埃希菌 (enterohemorrhagicEs cherichiacoli,EHEC)众多血清型中非常主要的一组。 1982年 ,美国首次发生了由此菌引起的出血性肠炎暴发。近几年 ,我国已陆续有 10余个省份在市售食品、进口食品、家畜家禽和腹泻病患者中检出该菌 ,1999年局部地区还发生了暴发流行 ,表明该病已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。O15 7∶H7菌株含有一个相对分子质量为 6 .0× 10 7的大质粒 ,能编码一种菌毛。毒力因子主要有质粒编码的菌毛和噬菌体编码的志贺样毒素 (Shiga liketoxin ,SLT)。O15 7∶H7毒力强 ,很少量细菌…     

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质.方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx28的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E. coli BL-21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot (WB)分析重组蛋白生物活性.结果:PCR扩增stx2b基因约220bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应.结论:成功克隆EHEC O157:H7 stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157:H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础.     

网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法：设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针，确定网状分枝扩增方法（RAM）的灵敏度；含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46∶H38、O22∶H8 、O111∶NM，用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株，并进一步对瞬时RAM进行研究。结果：RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株，表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性，而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中，28株细菌含有stx2基因，其余则为阴性， 与PCR检测结果100%一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌，检测信号的出现依赖于样品的浓度。 结论：RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157∶H7和STEC。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。     

江苏省徐州市分离的大肠杆菌O157:H7菌株携带志贺毒素2型别的变化

目的 研究我国分离的大肠杆菌O157：H7菌株的志贺毒素型别的变化。方法使用针对志贺毒素2及其变种的引物对进行PCR检测、细菌染色体DNA的PstⅠ酶切后的Southern印迹实验和PCR产物的HaeⅢ、RasⅠ酶切分析,以及：PCR产物克隆后的序列分析方法以及致病性大质粒的PstⅠ酶切分析。结果1999年分离自徐州市的人的5株菌均携带slt1、slt2,而2000年从江苏省徐州市患者分离的10株和蜣螂标本分离的4株共计14株大肠杆菌O157：H7菌株仅携带slt2vha毒素基因,其致病性质粒的限制性酶切图谱与1999年的菌株相比也发生了改变。结论鉴于江苏省徐州市1999年的分离的5菌株全部携带slt1和slt2基因,结果提示该地的优势菌型发生了改变,可能当地大肠杆菌O157：H7感染的流行病学特点有关。针对slt2变异基因而设计的引物及其以此为基础进行的限制性片段长度多态性分析的方法对于研究O157：H7菌株的志贺毒素型别的变化能够满足特异性及灵敏性的要求。     

应用多重引物PCR方法检测O157：H7毒力基因的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157：H7毒力的复合RSR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素I、Ⅱ的两对引物，在同一扩增体系中进行PCR，检测不同来源的大肠杆菌O157：H7及E．coli ATEEE5922株。结果 EHEC O157：H7 933W株扩增出两条志贺样毒素基因产物，而E．coli ATOC25922株和EHEC O157：H7 97-l-68的扩增结果均为阴性。结论 应用多重引物RCR方法检测大肠杆菌O157：H7毒力基因，简便、快速、特异、敏感，对流行病学调查分析、制定预防和控制对策有重要的参考价值。     

大肠埃希菌O157：H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测

目的了解大肠埃希菌O157：H7（EHEC O157：H7）在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况。方法将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯（S-MAC）琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列（API-20E）和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定。应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2（SLT1/SLT2）和侵袭相关基因。小白鼠腹腔注射法测定其毒力。K-B法做抗生素药敏试验。结果从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157：H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因。毒力试验使小白鼠发病死亡。药敏试验对14种抗生素敏感。结论云南战区存在EHEC O157：H7感染。建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157：H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段。     

大肠埃希菌O157∶H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测

目的 了解大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况.方法 将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列(API-20E)和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定.应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2(SLT1/SLT2)和侵袭相关基因.小白鼠腹腔注射法测定其毒力.K-B法做抗生素药敏试验.结果 从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157∶H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因.毒力试验使小白鼠发病死亡.药敏试验对14种抗生素敏感.结论 云南战区存在EHEC O157∶H7感染.建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157∶H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段.     

Studies on shiga-like toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli: purification and characterization of the toxin and development of methods for identifying the toxin

A simple purification method using DEAE cellulose column chromatography and immunoaffinity column chromatography was developed for purifying Shiga-like toxin produced by Escherichia coli O157:H7. About 0.75 mg of purified toxin was obtained from 5 liters of culture (62% recovery). The purified toxin was demonstrated to be immunologically, biologically and structurally indistinguishable from Shiga toxin. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for detection of Shiga-like toxin. In the ELISA assay, Shigella dysenteriae type 1, Escherichia coli O157:H7 and some strains of Escherichia coli isolated from traveller's diarrhea were positive. Shiga toxin-resistant Vero cells were isolated by treatment of the cells with nitrosoguanidine. Immunofluorescence studies showed that the mutant Vero cells had lost toxin binding capacity. Samples of S. dysenteriae type 1 and E. coli O157:H7 showed cytotoxicity to the parent cells, but not to the mutant cells. Samples of other organisms showed either no cytotoxicity or cytotoxicity to both cell lines. The results suggested that (1) the presence of a receptor for Shiga-like toxin on Vero cells is essential for expression of cytotoxicity of the toxin, (2) the mutant Vero cells could be used to identify Shiga-like toxin producing organisms.     

4种食源性致病菌污染状况调查

目的了解肇庆市食品中沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O157:H7和副溶血性弧菌的分布状况、动物储存宿主的种类、菌株生物学特点,初步确定可能污染上述致病菌的高危食品,为食物中毒监测提供科学依据。方法依据国标方法,采用进口显色培养基。对样本分别进行沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O127:H7和副溶血性弧茵分离、生化及血清学鉴定。结果监测生肉(猪、牛、鸡)、熟肉、水产品三类样品共58件,共检出致病菌6株,总检出率10．3％。其中分离沙门氏菌4株,检出率6．9％;单增李斯特菌2株,检出率3．4％:EHEC O157:H7和副溶血性弧菌均未检出。3类食品中致病菌阳性率最高的为生肉(17．9％),其次为水产品(5．0％),熟肉未检出致病菌。结论肇庆市居民主要消费食品存在食源性致病菌污染,其中生肉是主要污染食品品种,生肉(猪肉)中沙门氏菌带菌率较高(30．0％),主要血清型为德尔卑沙门氏菌,熟肉未检出致病菌。     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株的细胞毒性比较

目的 比较肠出血性大肠埃希菌流行菌株的细胞毒性,筛选强毒株,为进一步研究细菌的致病机理提供理论依据.方法 采用PCR技术鉴定菌株的毒力基因E-hlyA、stx2、stxl,Giemsa染色观察细菌的黏附情况,通过测定感染后Vero细胞的乳酸脱氢酶释放情况了解细菌的Vero细胞毒性强弱.结果 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株含有的毒力基因不同,均具有较强的黏附能力和Vero细胞毒性,其中国际菌株933W/O,中国流行菌株882364、01H112和日本菌株Cua9的Vero细胞毒性较强.结论 筛选出的流行菌株强毒株,可用于进一步的细菌感染模型构建和毒力基因致病机制研究.     

金乡县2005～2008年动物粪便O_(157)∶H7大肠杆菌带菌监测情况分析

目的为进一步摸清O157∶H7大肠杆菌在本地区动物携带情况,于2005～2008年采集金乡县部分农家动物粪便共计1654份。方法用免疫磁珠富集方法捕获O157∶H7,接种于山梨醇—麦康凯培养基,可疑菌落转种科玛嘉大肠杆菌O157∶H7显色培养基之后进行生化和血清学鉴定。结果4年从牛、鸡、猪、羊等动物粪便中共检出O157∶H7大肠杆菌59株,检出率为3.57%,其中牛携带率最高为8.02%,结论提示本地区有肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的可能,应加强动物管理和疫情监测,防止疫情扩散蔓延。     

检出山梨醇阳性肠出血性大肠杆菌O157:H7一例及特征分析

目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(entro-hemorrhaguc E.Coli O157:H7 or EHEC O157:H7)是具有强致病力的条件致病菌,该菌可通过污染的食物、水、以及直接接触感染的人或动物而感染。加强对该菌的检验,对预防与控制由该菌所致的感染流行十分重要。方法:本文参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0973-2000方法进行检验。结果:从进口冻猪肚中检出一例EHEC O157:H7,并用PCR方法检测VERO毒素呈阳性。结论:该菌株的生化特征与相关文献报道的EHEC O157:H7生化特征不同的是山梨醇阳性,棉籽糖阴性,检验过程中应慎重鉴别。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。