HO-1在小鼠内毒素急性肺损伤中的作用：与调控线粒体质量控制的关系

目的评价血红素氧合酶-1(HO-1)在小鼠内毒素急性肺损伤中的作用及其与调控线粒体质量控制的关系。方法清洁级健康雄性成年C57BL/6小鼠, 基于CRISPER/Cas9开发的EGE系统制备HO-1诱导性基因敲除小鼠, 并构建HO-1过表达腺病毒载体诱导HO-1基因过表达小鼠, 6～8周龄, 体重20～25 g, 采用随机数字表法, 将野生型C57BL/6(WT)、HO-1基因敲除型小鼠(HO-1-/-)和HO-1基因过表达型小鼠(HO-1+/+)分别分为2组(n=6):对照组(WT组、HO-1-/-组和HO-1+/+组)和内毒素急性肺损伤组(ALI组、HO-1-/-+ALI组和HO-1+/++ALI组)。经尾静脉注射LPS 15 mg/kg制备小鼠内毒素急性肺损伤模型, 各对照组给予等容量生理盐水。给予LPS或生理盐水后12 h时处死小鼠取肺组织, 光镜下观察肺组织病理学结果并进行肺损伤评分, 测定肺组织还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量, 计算GSH/GSSG比值, 透射电镜下观察线粒体超微结构, 测定线粒体膜电位(MMP)水平, 采用Western blot...     

内质网线粒体结构偶联在NLRP3 炎症小体形成与活化中的作用及机制研究进展

内质网线粒体结构偶联(endoplasmic reticulum–mitochondria contacts,ERMC)在细胞内不同的信号通路中发挥着重要作用,其结构异常可导致机体出现多种病理状态,进而引起多种疾病。近年来,有学者发现ERMC异常可促进内质网内钙离子转移至线粒体内最终引起线粒体钙超载,线粒体钙超载能够生成的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS可以促进NLRP3炎症小体的过度活化[1]。本综述主要针对ERMC在细胞内炎症小体形成过程中的作用。     

C57BL/6小鼠腹膜间皮细胞培养与鉴定

目的:建立C57BL/6小鼠腹膜间皮细胞(peritoneal-mesothelial-cells,PMCs)的体外培养方法。方法:选择8周龄C57BL/6雄性小鼠,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化C57BL/6小鼠大网膜,细胞悬液经离心培养,进行形态学及细胞免疫组化鉴定。结果:分离培养的C57BL/6小鼠PMCs倒置显微镜下呈小圆形细胞,部分细胞聚集成小串葡萄状;72 h所有贴壁细胞均伸展,呈梭形等,边缘不整,细胞呈现拉网生长,与相邻的细胞相互连接;HE染色呈现多边形、椭圆形、短梭形,细胞浆染为淡红色;细胞免疫荧光组化鉴定上皮细胞标志分子E-cadherin及间充质标志分子Vimentin表达呈阳性,证实培养的细胞为PMCs。结论:C57BL/6小鼠腹膜间皮体外细胞培养成功,可为后续腹膜透析相关腹膜纤维化相关体外研究的开展提供可靠的细胞模型。     

血红素加氧酶-1在心脏移植急性排斥反应中的表达及意义

目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)在心脏移植急性排斥反应中的表达及意义。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型。实验分为同系移植组(C57BL／6小鼠→C57BL／6小鼠)和同种移植组(BAILB／c小鼠→C57BL／6小鼠)。免疫组织化学和RT-PCR方法观察HO-1在心肌组织的表达；普鲁士兰染色法观察铁在心肌组织的沉积情况。结果 HO1主要在浸润的炎性细胞中表达，铁在浸润的巨噬细胞中表达，二者随急性排斥反应的加重表达上调。结论 HO-1参与了心脏移植急性排斥反应的病理过程；HO-1在炎性细胞的过表达，可作为心脏移植急性排斥反应的监测指标。     

脂多糖所致脓毒症诱导的急性肺损伤肺组织T淋巴细胞活化及共刺激分子表达的研究

目的研究腹腔注射脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)模型肺组织T淋巴细胞活化状态。方法健康雄性C57BL/6随机分为生理盐水(NS)腹腔注射组,LPS腹腔注射组,每组4只。模型建立后3 h,获取两组小鼠肺组织细胞并进行T淋巴细胞各亚群及活化指标染色,采用流式细胞术检测。结果与对照组(NS)相比,LPS腹腔注射组小鼠肺组织内抑制性共刺激分子PD-1、CD40/CD40L、CTLA-4在CD4~+和CD8~+T细胞表达水平均显著升高(P0.05),协同共刺激分子CD28(MFI:298.50±4.44)表达水平降低;与对照组相比,早期活化分子CD69在LPS诱导的急性肺损伤模型小鼠肺组织内CD4~+T(MFI:848.30±95.57;t=6.8670,P0.001)和CD8~+T淋巴细胞的表达水平显著升高(MFI:606.00±95.54;t=4.8780,P0.01);晚期活化分子CD38在CD4~+T细胞表达显著升高(MFI:69.38±2.86;t=4.1150,P0.01),在CD8~+T细胞表达无明显升高。结论 LPS诱导的急性肺损伤能够导致肺组织内T淋巴细胞早期活化,并且能够上调其多种抑制性共刺激分子表达,提示T淋巴细胞可能在ALI中发挥重要作用。     

衰老肾脏时钟基因的表达

目的探索可能影响肾脏衰老的相关基因, 并验证时钟基因Arntl在衰老肾脏中的表达变化。方法通过全转录组测序鉴定C57BL/6雄性24月龄小鼠(衰老组)和3月龄小鼠(年轻组)的差异表达基因, 并通过生物信息学方法分析其所富集的生物学通路及关键蛋白。应用实时荧光定量PCR和Western印迹验证Arntl的mRNA及蛋白表达量。结果 (1)全转录组测序结果显示在C57BL/6衰老组小鼠及年轻组小鼠中共筛选出119个显著差异表达基因。差异表达基因主要富集于节律过程、昼夜节律、基因表达的昼夜调控等生物学过程(均P<0.001)。蛋白质互作网络分析结果显示, Nfil3、Hspa8、Arntl、Hlf、Rorc、Per3、Npas2等是差异表达基因中的关键蛋白。时钟基因Arntl、Nfil3、Npas2、Per3在衰老组及年轻组小鼠之间的mRNA表达差异(均P<0.05)与测序结果一致。(2)相较于C57BL/6年轻组小鼠和SAMR1快速老化小鼠, Arntl蛋白表达量在衰老组小鼠和SAMP8快速老化小鼠肾脏组织中均有下降趋势。结论时钟基因及其参与的昼夜节律生物学通路可能在肾脏衰老过...     

放射性损伤对骨髓来源干细胞分化为实体细胞的影响

目的 观察骨髓来源干细胞(BMDSCs)能否在体分化为其他实体组织细胞.方法 野生型C57BL/6J雌性小鼠作为受体接受10 Gy的射线照射后,经尾静脉植入同等背景的转增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的C57BL/6J雄性小鼠(绿鼠)骨髓细胞1×107个/只.移植受体稳定1年后检测各组织中EGFP的表达.结果 野生型小鼠各组织中EGFP的表达为0%,绿鼠各组织中EGFP的表达为100%.受体鼠各组织均有EGFP阳性细胞分布,表达率为100%,与野生型比较差异有统计学意义(P<0.01),但是表达强度均低于绿鼠组.EGFP阳性细胞主要存在于皮肤组织角质形成细胞、毛囊上皮,以及肺间质、支气管上皮、肺泡上皮中.结论 BMDSCs能在体内分化为其他实体细胞,并有组织特异性.     

BNIP3L与脓毒症相关性脑病小鼠海马线粒体功能障碍的关系

目的评价BCL2/腺病毒E1B19 kDa蛋白相互作用蛋白3(BNIP3L)与脓毒症相关性脑病(SAE)小鼠海马线粒体功能障碍的关系。方法 SPF级C57BL/6雄性小鼠180只, 6～8周龄, 体质量20～25 g, 采用随机数字表法分为4组(n=45):对照组(C组)、假手术组(Sham组)、SAE组和SAE+BNIP3L激动剂卡非佐米组(SC组)。采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症模型。SC组术后2 h腹腔注射卡非佐米2 mg/kg。各组取20只小鼠, 观察7 d生存情况。术后1周时, 取8只生存的小鼠进行水迷宫实验。其余小鼠术后24 h时处死, 取海马组织, 采用免疫荧光法测定海马组织BNIP3L表达, Western blot法测定线粒体BNIP3L表达, 并观察线粒体超微结构。采用荧光素-荧光酶发光法测定线粒体ATP含量, 荧光分光光度法测定线粒体膜电位(MMP)。结果与C组和Sham组比较, SAE组生存率降低, 逃避潜伏期延长, 目标象限停留时间和穿越原平台区域次数减少, 海马线粒体BNIP3L表达下调, MMP和线粒体ATP含量降低(P<0.05), 海马组织BNIP...     

磷酸盐缓冲液纯化许旺细胞的实验研究

目的 探索应用磷酸盐缓冲液(PBS)纯化新生小鼠许旺细胞的可行性. 方法 取新生(出生5～7 d)C57BL/6小鼠的坐骨神经,采用0.2%的复合胶原酶NB4消化获取许旺细胞,然后采用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养24 h.在16℃～20℃PBS中振荡差速分离纯化许旺细胞,48 h后再重复1次,共进行两次纯化.每次纯化后应用S-100免疫荧光组化法鉴定许旺细胞的纯度. 结果 应用16℃～20℃PBS纯化新生鼠坐骨神经来源的许旺细胞2次后,经免疫荧光组化法鉴定许旺细胞纯度可达98%以上. 结论 该法可以纯化新生小鼠坐骨神经来源的许旺细胞,是一种经济和高效的纯化新方法.     

输注分子嵌合前体T细胞减低小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠T细胞的刺激反应

目的构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠前体T细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞减低对异基因小鼠T细胞反应的可行性。方法体外分离培养BALB/c小鼠前体T细胞,构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因(H-2Db和H-2Kb)真核表达载体pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb,分别转染BALB/c小鼠前体T细胞,构建分子嵌合前体T细胞。将分子嵌合前体T细胞回输BALB/c小鼠后7天,获取脾脏T淋巴细胞,与C57BL/6小鼠T细胞进行混合淋巴细胞培养,观测刺激指数(SI)。结果成功体外培养BALB/c小鼠前体T细胞,体外转染C57BL/6小鼠H-2Db和H-2Kb基因至BALB/c小鼠前体T细胞,H-2Db和H-2Kb蛋白表达率分别可达(14.90±0.56)%和(14.20±0.63)%。单向混合淋巴细胞培养显示,输注分子嵌合前体T细胞的BALB/c小鼠脾脏T细胞对C57BL/6小鼠T细胞SI,在pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb转染的小鼠前体T细胞共注射组为(0.764±0.074),比空质粒组(0.983±0.081)和未转染组(0.994±0.142)明显下降(均P<0.05)。共注射组SI值分别与转染质粒pIRES-H-2Db组SI值(0.859±0.085)和转染质粒pIRES-H-2Kb组SI值(0.860±0.097)相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因前体T细胞的小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠T细胞刺激反应明显减低。     

信号转导和转录激活因子5在小鼠CD4+CD25+调节性T细胞中的表达

目的:观察信号转导和转录激活因子5(STAT5)在小鼠CD4+CD25+调节性T细胞中的表达情况.方法:免疫磁珠法分离C57BL/6J小鼠脾脏中的CD4+CD25+调节性T细胞,共聚焦荧光法检测细胞内STAT5的分布并进行初步定位,进一步采用Western blot技术从蛋白水平检测细胞内STAT5的表达.结果:激光共...     

经诱导的绿色荧光蛋白转基因C57BL雄鼠脾细胞移植重建雌鼠造血功能研究

目的探讨雄性C57BL绿色荧光蛋白（GFP）鼠诱导的脾细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用。方法建立小鼠造血衰竭模型,移植鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞,检测诱导后细胞的干细胞标志抗原表达;观察受体存活时间,检测外周血白细胞计数、外周血GFP阳性细胞,进行荧光原位杂交检测Y染色体;各组受体脾和肺切片观察GFP细胞分布。结果鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞比未诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原。1×106个脾细胞经尾静脉回输经致死剂量照射的雌性小鼠,明显延长小鼠存活时问,提高小鼠外周血白细胞计数。诱导组受体外周血中检测到GFP阳性细胞,骨髓中检测出60％的细胞含Y染色体。诱导组受体脾和肺切片观察到GFP阳性细胞分布。结论鱼卵提取物诱导的小鼠脾细胞中含较多的多能干细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建其造血功能。     

表皮生长因子在ARDS小鼠肺组织修复中的作用

目的:评价表皮生长因子(EGF)在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠肺组织修复中的作用。方法:SPF级雄性C57BL/6小鼠50只,6~8周龄,体重21~23 g,采用随机数字表法将小鼠分为5组( n＝10)：对照组(C组)、EGF组、LPS+PBS组、LPS+EGF组和AG1478+LPS+EGF组。C组...     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DNFGFR1在小鼠BMSCs中的表达及意义

目的探讨含有基因成纤维细胞生长因子受体1显性负性分子(DN FGFR1)的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DNFGFR1转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后的表达及意义。方法体外分离培养C57/BL小鼠BMSCs,应用综合贴壁的方法纯化BMSCs。由阳离子脂质体介导将pcDNA3.1(+)-DNFGFR1转入BMSCs中,用RT-PCR法检测DNFGFR1mRNA的表达。结果小鼠BMSCs原代培养24h后见细胞贴壁伴有伸展现象,细胞核清晰,10d左右细胞密度明显增加,细胞形成单层,融合率达80%,综合贴壁培养使BMSCs更纯。转染组条带灰度值与β-actin比值(3.8)明显高于未转染组(0.5)。结论 pcDNA3.1(+)-DNFGFR1质粒能被导入BMSCs并得到表达,为研究FGFR1的功能奠定了实验基础。     

西格列汀对小鼠内毒素性肺损伤时黏蛋白5AC表达的影响

目的评价西格列汀对小鼠内毒素性肺损伤时黏蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响。方法 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠36只, 6～8周龄, 体质量20～25 g, 按照随机数字表法分为3组(n=12):对照组(C组)、内毒素性肺损伤组(L组)和内毒素性肺损伤+西格列汀组(S组)。L组和S组气管内滴注LPS 3 mg/kg制备小鼠内毒素性肺损伤模型, C组小鼠气管内滴注等量生理盐水。S组于LPS滴注前1 h腹腔注射西格列汀100 mg/kg, C组和L组小鼠于气管内滴注生理盐水前1 h腹腔注射生理盐水。LPS或生理盐水滴注后24 h时经股动脉采血行动脉血气分析测定PaO2及葡萄糖水平, 随后处死小鼠收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织, ELISA法检测血清及BALF IL-6、IL-1β和TNF-α浓度。称重后计算肺组织湿质量/干质量(W/D)比值, HE染色法观察肺组织病理学结果并行肺损伤评分, 采用免疫组化法及免疫组化综合评分法检测MUC5AC的表达, 采用qRT-PCR法检测肺组织MUC5AC的mRNA表达水平。结果与C组比较, L组和S组PaO2降低, 葡萄糖水平、W/D...     

异丙酚对小鼠神经干细胞增殖的影响及Sp1-EGFR-Akt信号通路在其中的作用

目的:评价异丙酚对小鼠神经干细胞增殖的影响及转录因子特异性蛋白1(Sp1)-表皮生长因子受体(EGFR)-蛋白激酶B(Akt)信号通路在其中的作用。方法:分离和培养C57BL/6小鼠原代神经干细胞,稳定传代后使用免疫荧光染色鉴定。取第3~6代神经干细胞,采用随机数字表法分为3组( n＝21)：生理盐水对照组...     

内质网IRE1α/XBP1信号通路在小鼠内毒素性急性肺损伤中的作用：与NLRP3炎症小体的关系

目的评价内质网肌醇需要酶1α/X盒结合蛋白1(IRE1α/XBP1)信号通路在小鼠内毒素性急性肺损伤(ALI)中的作用及其与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的关系。方法 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠36只, 6～8周龄, 体质量25～30 g, 采用随机数字表法分为3组(n=12):对照组(C组)、内毒素性ALI组(ALI组)和内毒素性ALI+STF-083010组(ST组)。ALI组和ST组雾化吸入LPS 3 mg/ml 30 min制备小鼠内毒素性ALI模型, C组雾化吸入等量生理盐水, ST组于雾化吸入LPS前1 h时腹腔注射IRE1α/XBP1信号通路阻断剂STF-083010 50 mg/kg, 其余2组腹腔注射等容量生理盐水。LPS或生理盐水雾化吸入后24 h时处死小鼠, 收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并取肺组织标本, 肺组织HE染色后光镜观察病理学结果, 行肺损伤评分并计算肺湿重/干重(W/D)比值;ELISA法测定BALF上清液IL-1β和IL-18浓度;Western blot法检测肺组织p-IRE1α、XBP1s、NLRP3、ASC和...     

竹叶青蛇毒诱导不同品系小鼠系膜增生性肾炎模型的比较研究

目的：探讨竹叶青蛇毒（habu snake venom,HSV）诱导C57BL/6小鼠和FVB/N小鼠系膜增生性肾炎模型的病理差异,为实验动物模型的选择提供科学依据。方法：取8周龄雄性C57BL/6小鼠（n=33）和FVB/N小鼠（n=52）,单次尾静脉注射2.5 mg/kg竹叶青蛇毒建立模型。定期检测血尿素氮和肌酐水平,观察肾组织病理改变并进行病理评分,观察肾小球内PCNA免疫组化染色情况。结果：FVB/N小鼠的存活率（53.2%）明显低于C57BL/6小鼠（89.3%）。肾组织病理表现为C57BL/6小鼠在蛇毒注射后的第1和3天肾小球内出现显著系膜溶解病变,第7天肾小球系膜细胞增殖和系膜基质积聚,第14、21天病变肾小球逐渐恢复正常。FVB/N小鼠注射后第1和3天系膜溶解病变不显著,第7天存在系膜细胞增生,但病变程度低于同期C57BL/6小鼠。病理评分结果示C57BL/6小鼠在模型建立后系膜溶解指数和肾小球硬化指数均高于同期FVB/N小鼠。免疫组化结果显示两种小鼠肾小球内PCNA阳性率在第3、7天均显著高于对照组,其中C57BL/6小鼠肾小球内PCNA表达在第3天高于FVB/N小鼠。结论：静脉注射HSV能诱导小鼠发生系膜增生性肾炎病理改变,C57BL/6小鼠对该模型的耐受性和易感性均优于FVB/N小鼠。     

XBP1s条件性过表达定点敲入小鼠模型的建立

目的获得可进行条件性过表达XBP1s基因的Rosa 26定点敲入杂合子小鼠。 方法通过In-Fusion Cloning的方法构建胚胎干细胞(ES细胞)打靶载体,并进行线性化,电转染JM8A3 ES细胞。药物筛选获得抗性ES细胞克隆,经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果经酶切鉴定证明打靶质粒构建成功,经胚胎干细胞打靶共获得144个抗性ES细胞克隆,通过长片段PCR的方式对同源重组阳性克隆进行筛选和克隆经测序确认,共获得21个正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞克隆E3、C6经扩增后注射C57BL/6J小鼠囊胚96个,通过胚胎移植,共获得2只高嵌合雄鼠,与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得3只F1代杂合小鼠,经PCR及测序鉴定正确。 结论成功建立了XBP1s基因的Rosa26定点敲入F1代杂合子小鼠,为未来获得免疫细胞、肾脏固有细胞及腹膜间皮细胞XBP1s条件性敲入小鼠奠定了基础。