小鼠β2m正反义核酸表达载体转染NIH3T3细胞后的表达

目的:探讨小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN对NIH3T3细胞表达β₂m的影响, 为降低MHCⅠ类分子表达的研究提供新方法和实验依据。方法:本研究应用分子生物学技术,构建小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN,用脂质体转染NIH3T3细胞。经过RT-PCR及Western blot检测,观察正、反义核酸对细胞β₂m mRNA和蛋白表达的影响。 结果: 小鼠β₂m正、反义核酸表达载体成功导入NIH3T3细胞中,且有效表达,转染正义核酸的细胞β₂m mRNA和蛋白表达水平升高,而转染反义核酸则β₂m mRNA和蛋白表达水平降低。 结论:小鼠β₂m反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mAN可以降低NIH3T3细胞β₂m基因的表达,本研究结果为降低MHCⅠ类分子的表达、解决同种异体排斥反应提供了新的研究方法和途径。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。     

Septin8红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的septin8红色荧光蛋白融合表达载体（pmCherry—C2／septin8），并观察其在细胞内的表达和定位情况。方法采用PCR的方法从人脑胶质细胞瘤eDNA文库中扩增获得septin8基因编码区序列，将其克隆至红色荧光蛋白载体pmCherry—C2上，重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后转染NIH3T3细胞，并利用Westernblotting和细胞免疫化学技术分析重组蛋白在细胞内的表达和定位。结果重组pmCherry—C2／septin8融合蛋白在NIH3T3细胞中得到高量表达且主要分布于细胞浆。结论成功构建了pmCherry—C2／septin8融合表达载体，该载体能在哺乳动物细胞NIH3T3中表达，为进一步研究septin8细胞内生物学功能打下了良好的基础。     

大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况.方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PTKL459K-IL-4-PT38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-rIP-10-PE38KDEL.重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH 3T3细胞的表达.结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆人真核表达质粒载体pcDNA3.1( ),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH 3T3细胞表达.结论 rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH 3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础.     

ErbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响

目的：探讨erbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响。方法：将真核表达质粒pEGFP—C1和Ebpl基因经双酶切后用T4连接酶连接，并经鉴定序列正确后，用脂质体转染剂Lipofectin Reagent稳定转染NIH3T3细胞，免疫细胞化学显色，在激光共聚焦扫描显微镜下观察Ebp1蛋白的表达和定位；通过平板集落形成率观察细胞生长增殖能力的改变。结果：重组质粒鉴定正确，成功构建Ebp1稳定表达的NIH3T3细胞系，并存显微镜下可见绿色荧光，免疫细胞化学显色可见Ebp1蛋白表达；转染目的基因的细胞克隆形成率明显升高。结论：成功构建Ebp1稳定表达细胞系，Ebp1融合蛋白表达于胞质，呈不均匀颗粒状、环状分布；Ebp1在体外能增强NIH3T3细胞生长增殖。     

小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

Smad7过度表达抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

研究Smad7过度表达对TGF β1基因表达的调控和对 3T3细胞增殖的影响。实验将Smad7质粒 ,通过脂质体介导转染NIH3T3细胞 ,应用RT PCR方法鉴定转染结果和检测TGF β1mRNA的表达 ,以及用免疫细胞化学检测TGF β1蛋白的表达情况 ,并观察基因转染对细胞增殖的影响。结果显示转染Smad7后 ,NIH3T3细胞中TGF β1mRNA的表达显著减少 (P <0 0 5 ) ,TGF β1蛋白的表达下降 ,细胞增殖明显减缓 (P <0 0 5 )。提示Smad7过度表达能够抑制 3T3细胞的增殖和TGF β1基因的表达 ,可以通过阻断TGF β细胞内信号传导来调控TGF β1的生物学行为。     

SH2A 基因对细胞信号转导的影响及其亚细胞定位

目的 研究Src同源域2(src homology 2，SH2)A基因在细胞信号转导中的作用并进行亚细胞定位。方法 通过RT—PCR方法扩增SH2A cDNA编码序列，构建真核重组表达载体pcDNA3．1-SH2A，利用脂质体转染肝癌Bel7402细胞、COS7细胞，检测蛋白酶C(protein kinaseC，PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)活性的改变；另构建pEGEP—SH2A，转染同前，荧光显微镜观察荧光定位。结果 测序结果显示真核重组表达载体pcDNA3．1-SH2A及pEGFP—SH2A中均含有SH2AcDNA编码序列；肝癌Bel7402细胞、COS7细胞转染pcDNA3．1-SH2A后，胞浆PKC的活性下降了40％左右，MAPK和TPK活性未见明显改变。荧光显微镜观察发现SH2A基因在细胞质中表达。结论 SH2A基因编码蛋白在PKC信号转导通路中起抑制作用；SH2A基因编码蛋白定位于细胞质。     

EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达

目的　寻找在真核细胞中表达Epstein Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白 2 (Latentmembraneprotein 2 ,LMP2 )的有效途径 ,研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法　将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上 ,通过脂质体将重组质粒导入PT6 7细胞 ,G418筛选抗性克隆 ,收集含重组病毒的上清 ,将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3 ,测定病毒滴度 ,提取转染细胞DNA进行PCR鉴定 ,间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。结果　培养上清的病毒滴度为 5 .8× 10 5 PFU ml,聚合酶链反应 (PCR)结果证实 ,转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。结论　重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达     

反义核酸抑制B16黑色素瘤细胞tyr基因的表达

目的：用反义核酸技术抑制小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因（tyr）的表达。 方法： 构建tyr反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，用脂质体法导入B16细胞，用酪氨酸酶活性及黑色素含量测定，多巴染色及透射电镜等检测由反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr转录产生的tyr反义核酸对B16细胞tyr表达的抑制情况。 结果： 成功构建了反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，转染了反义重组体的B16细胞其酪氨酸酶活性为0.0498±0.0036，显著低于对未转染组B16细胞的0.0916±0.0132(P<0.01);转染空质粒pcDNA3.1(-)及真核表达重组体pcDNA3.1(+)-tyr组B16细胞的氨酸酶活性分别为0.1015±0.0166和0.0948±0.0096,两者同对照组相比均无显著差异(P>0.05)。多巴染色及电镜观察结果表明转染了反义重组体的B16细胞其黑色素颗粒的含量明显低于对照组。 结论： 反义核酸可以显著抑制B16黑色素瘤细胞tyr的表达。     

重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒在软骨细胞的表达

背景：白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓骨性关节炎进程,通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。 目的：观察重组人重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况。 方法：双酶切法切取重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的c-DNA片段,通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上。体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白质粒经脂质体转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。 结果与结论：获得重组人pEGFP-C1-IL-1Ra真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确。荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞基因得到表达。