人白细胞介素-10真核表达载体的构建及其在兔滑膜细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素-10(hIL-10)高效真核表达载体,观察其在家兔滑膜细胞(RSCs)中表达.方法 提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA作为模板,根据基因库(NM 000572)中hIL-10全长开放读框设计特异性引物,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法扩增hIL-10 mRNA全长开放读框,扩增产物定向克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA,并对克隆人真核表达载体的扩增产物进行酶切及DNA测序鉴定,构建的真核表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10经阳离子脂质体介导转染兔滑膜细胞RSCs.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后12、24、48、72 h和7、14 d RSCs培养上清中hIL-10水平.结果 RT-PCR产物约0.54 kb,克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA的扩增产物经酶切及DNA测序鉴定与读码框架序列无差别.转染后12 h到第7天细胞培养上清检测出hIL-10,且水平显著性高于对照组(F=21.878,P＜0.01).结论 hIL-10真核高效表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10构建成功.     

肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定

目的构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB—PEG10-EGFP，为制备转基因小鼠做准备。方法RT—PCR扩增PEG10基因cDNA序列，克隆入T载体进行酶切、测序鉴定，后将其定向克隆至真核表达载体pALB．EGFP中ALB的下游，构建转基因载体pALB—PEG10-EGFP；在Lipofectamine介导下转染L02细胞，经G418抗性筛选，挑选阳性克隆并扩大培养；采用RT—PCR、Westernb1ot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在L02细胞中的表达和细胞内定位。结果酶切和测序结果表明pALB—PEG10-EGFP构建成功；稳定转染后的L02表达有PEG10的mRNA及蛋白，且主要定位于胞浆。结论重组体pALB—PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础。     

高效表达人端粒酶RNA逆转录病毒的构建及其对肝细胞增殖的影响

背景:基因修饰供体肝细胞以提高其增殖能力是改善肝细胞移植疗效的关键,人端粒酶RNA(hTR)基因是上调端粒酶活性、促进肝细胞增殖的一个重要因素,与肝细胞增殖密切相关。目的:构建新型高效表达hTR的逆转录病毒,体外感染原代培养肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响。方法:将hTRcDNA片段与能促进RNA表达的启动子H1连接后,插入逆转录病毒载体pLXSN基因组中,获得重组逆转录病毒载体pLXSN-H1-hTR,DH5α细菌内扩增后,与辅助包装质粒pCL-Ampho共转染包装细胞293-T后获得可表达hTR的逆转录病毒,测定滴度,感染原代培养肝细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTR在肝细胞中的表达,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法观察hTR过表达对细胞增殖影响。结果:经抗生素筛选和限制性核酸内切酶酶切、测序鉴定,最终获得滴度为2×106菌落形成单位(cfu)/ml高效表达hTR的重组逆转录病毒——Re-H1-hTR;Re-H1-hTR感染组hTR表达最为明显;病毒Re-H1-hTR感染的肝细胞株Super-YL和Re-hTR感染的肝细胞株YL增殖能力均较对照组明显增强,其中肝细胞株Super-YL增殖水平较YL上调更为明显(P<0.05)。结论:利用新型表达hTR的重组逆转录病毒可将外源hTR基因导入肝细胞中,并维持高效表达,可显著提高肝细胞增殖能力,为基因修饰移植肝细胞提供新的手段。     

肝细胞中HBV X基因的表达及其共培养的肝星状细胞的增殖和迁移

目的:研究乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBV X)基因在乙型肝炎病毒致肝纤维化中的作用.方法:构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP,将其转染人肝细胞HL-7702后分成2组,一组经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株(L02/x),另一组予瞬时转染48 h(L02/48x).Real-time PCR、Western blot鉴定2组细胞HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,将L02/x和L02/48x细胞分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)共培养36 h,并检测各组HSCs增殖和迁移情况.结果:Real-time PCR和Western blot实验显示,转染pHBV-X-IRES2-EGFP载体的L02/x和L02/48x细胞均有HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,与L02/x和L02/48x细胞共培养的HSCs的增殖和迁移均显著增多.结论:HBV X基因在肝细胞中的表达可以促进HSCs发生增殖和迁移,从而在乙型肝炎病毒致肝纤维化过程中起重要作用.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

体外培养的肝癌细胞株与正常肝细胞株蛋白质的差异表达

目的:运用SELDI蛋白质芯片技术分析体外培养的肝癌细胞株(HepG2)与正常肝细胞株(L02)蛋白质表达差异．方法:在体外培养HepG2和L02细胞株,收获细胞,将细胞用细胞裂解液裂解后,采用SELDI蛋白质芯片技术用IMAC3 及WCX2芯片检测HepG2、L02的蛋白质谱．结果:体外培养的肝癌细胞株与正常肝细胞株的蛋白质存在差异表达,IMAC3芯片共捕获61个蛋白,发现差异峰7个,与 L02细胞相比,其中3个差异蛋白在肝癌细胞中高表达,4个差异蛋白在肝癌细胞中低表达．WCX2芯片共捕获91个蛋白, 发现差异峰14个,其中3个差异蛋白在肝癌细胞中高表达,11 个差异蛋白在肝癌细胞中低表达．结论:SELDI蛋白芯片技术检测肝癌细胞株与正常肝细胞株蛋白质的差异表达方法简便,敏感性高,重复性好．     

人肝细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的：构建肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体，为基因修饰肝细胞移植的细胞来源及建立HGF的工程细胞株提供实验依据。方法：利用DNA体外重组技术，将HGFcDNA重组人真核表达载体PEGFP-C，限制性内切酶及测序鉴定聚合酶链式反应(PCR)鉴定外源基因的导入。结果：重组真核表达载体PEGFP-C1-HGF经限制性内切酶分析，与理论值相符，测序结果与Gene Bank对比，序列正确，插入正确。结论：成功构建带有绿荧光蛋白的HGF基因真核表达载体PEGFP-C1-HGF。     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

人遗传印记基因PEG10重组真核表达质粒的构建及其在转染细胞株中的表达

目的构建人遗传印记基因PEG10的全长表达基因质粒,观察PEG10的过表达对人正常肝细胞及其非肝脏来源的对照细胞的作用。方法将PEG10基因全长cDNA直接连入真核细胞表达质粒pcDNA3．1hisC中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pcDNA3．1hisC-PEG10转染入人正常肝细胞及其对照细胞,采用RT-PCR、Western blot、MTT、TUNEL等方法分析PEG10基因在正常人肝细胞及其对照细胞中的表达和功能。结果限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建质粒为PEG 10全长表达质粒。该质粒经过稳定筛选后稳定表达于细胞内,促进人肝细胞的生长,抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞没有明显影响。结论PEG10全长表达质粒的构建为进一步研究PEG10基因的效应和机制提供了有利的工具,研究结果显示PEG10基因可以促进人正常胚肝细胞增殖并抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞人胚肾细胞株293细胞没有明显效应。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

反义IL-5载体构建及其对IL-5 mRNA和蛋白表达的影响

目的构建含反义IL-5的重组腺相关病毒(rAAV)asIL-5,观察rAAV asIL-5对哮喘大鼠CD+4T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白表达的影响。方法用基因重组方法构建反义IL5rAAV真核表达载体质粒pasIL-5/rAAV,磷酸钙沉淀法将真核表达载体质粒pasIL-5/rAAV、包装质粒pXX2、辅助质粒pXX6共转染入病毒包装细胞293细胞中,合成rAAV asIL5,Southernblot测重组病毒的滴度;将rAAV asIL5转染经密度梯度法和免疫磁珠法分离的哮喘大鼠CD+4T淋巴细胞,用半定量RT PCR、ELISA分别检测转染后细胞内IL5mRNA及细胞培养上清液中IL-5蛋白的表达水平。结果(1)成功构建并鉴定了rAAV asIL-5,滴度为1.3×1011病毒颗粒/ml;(2)病毒转染孔的相对吸光度值为1.0515±0.1477,低于对照孔(1.4271±0.1655,P<0.01);(3)细胞培养上清液中IL-5的含量病毒转染孔为(12.0840±1.4769)ng/L,低于对照组[(15.3590±1.2685)ng/L,P<0.01]。结论rAAV asIL-5能够抑制哮喘大鼠CD+4T淋巴细胞IL5mRNA和蛋白表达,为研究哮喘的基因治疗提供了实验依据。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

Construction of IL-2 gene-modified human hepatocyte and its cultivation with microcarrier

AIM: To construct interleukin-2 gene-modified human hepatocyte line (L-02/IL-2) and investigate the changes of the function of liver cells and IL-2 secretion in culture with microcarrier,laying the foundation for further experimentation on hepatocyte transplantation. METHODS: hIL-2 gene was transduced into L-02 hepatocytes by recombinant retroviral vector pLNCIL-2, and the changes of morphology and clonogenicity rate of the transduced cells were observed, the secretion levels of hIL-2 in cultural supernatant were detected by ELISA and NeoR gene was amplified by PCR. The growth of L-02/IL-2, the special biochemistry items and the levels of IL-2 were detected after cultivation with microcarrier. RESULTS: The clonogenicity rate of the L-02/IL-2 cells was lower than that of L-02/Neo cells and L-02 cells. The levels of hIL-2 could reach 32,000 pg/10(6) cells per day and kept secreting for more than ten weeks. NeoR gene segment was respectively obtained by PCR from both L-02/IL-2 and L-02/Neo cell's genomic DNA. At the 6(th) day in culture with microcarrier, the matrix-induced liver cell aggregates were formed, the number of alive L-02/IL-2 cell were 16.8+/-0.53 x 10(6)/flask and the levels of ALB and UREA were 52.54+/-1.28 mg/L and 5.29+/-0.17 mmol/L, respectively. These data had not significantly changed as compared with those of L-02 cells (P>0.05); However, the levels of IL-2 in IL-2/L-02 cells remarkably exceeded that in L-02 cells in the whole culture process (P<0.001). CONCLUSION: The IL-2 gene-modified hepatocyte line has been successfully constructed. The L-02/IL-2 cellular aggregates cultured with microcarrier have a high capacity of IL-2 production as well as protein synthesis and amino acid metabolism.     

HEV ORF3真核表达载体的构建、鉴定和真核表达

目的构建表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3-pXF2RH融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的L02细胞系。方法利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,HindⅢ/EcolⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pXF2RH真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pXF2RH。将阳性克隆用脂质体法转染L02细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定ORF3-pXF2RH融合蛋白的表达。结果真核表达质粒转染L02细胞,SDS-PAGE显示在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带。结论成功构建ORF3-pXF2RH真核表达质粒,在L02细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。     

人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人脂联素（APM1）基因真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达水平。方法用PCR法从测序正确的pGEM-T-APM1质粒上，扩增出两端带有Sfi Ⅰ酶切位点的人脂联素基因，再将扩增出的片段亚克隆到T载体上，用sfi Ⅰ酶切T载体和pCDEF空载体，将酶切后的片段进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF—APM1质粒转染HEK293细胞，ELISA检测培养上清中脂联素的水平。结果构建的pCDEF-APM1质粒能有效转染HEK293细胞，并在培养上清中检测到较高水平的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在HEK293细胞中获得高效表达。