DNA条形码技术在1例社鼠鉴定中的应用

目的以捕获的未知鼠为对象,应用DNA条形码技术进行鼠种鉴定,验证该方法在啮齿动物鉴定的可行性。方法以动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)作为目标基因,PCR扩增、测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上运用基于局部比对算法的搜索工具(BLAST)程序进行序列同源性比较和分析,检验其结果是否与该动物的外部形态和头骨标本鉴定结果相同。结果样本线粒体COI基因与基因库(GenBank)中编号为KJ152220.1的社鼠(Niviventer confucianus)同源性为99.01%,再结合形态学鉴定结果,可以确定该未知鼠种为社鼠,DNA条形码鉴定结果与形态学鉴定结果相一致。结论 DNA条形码技术可作为形态学鉴定的辅助方法,能用于鼠类标本的分类鉴定。     

DNA条形码识别——DNA条形码与DNA芯片识别蚊媒准确性的比较

〔目的〕比较DNA条形码和DNA芯片这2种技术平台在口岸医学媒介蚊类识别中的准确性。〔方法〕以20种媒介蚊类的线粒体COI基因序列信息为分析对象,采用NJ邻接法计算公认的DNA条形码区域在物种识别中的准确性,采用DNA芯片技术分析2种长度探针在物种水平识别中的差异。〔结果〕DNA条形码的准确性为98.5%,数据集中95%物种的唯一序列最短长度为50bp左右;DNA芯片的准确性为90%～98.4%,25bp探针比55bp探针更具优势。〔结论〕DNA条形码和DNA芯片都能够准确地识别20种媒介蚊类,DNA条形码芯片技术有望在口岸出入境检验检疫领域得到应用。     

福建口岸三蚊种COI基因序列分析

〔目的〕分析福建口岸白纹伊蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列,为建立蚊种分子鉴定方法奠定基础。〔方法〕扩增并测定在福建口岸采集的白纹伊蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊COI基因序列,与GenBank中相应序列进行对比分析。〔结果〕三蚊种COI基因扩增片段长度约500bp,A+T含量为65.61%~68.73%。核苷酸同源性分析结果表明,同一蚊种COI基因同源性为98.1%~100%,三蚊种间基因同源性为84.4%~87.7%;COI部分基因系统进化关系显示,三蚊种COI分子鉴定与形态学鉴定结果一致,阿蚊属与伊蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊亚科位于系统进化树另一分支。〔结论〕COI基因核苷酸序列分析可应用于福建国境口岸三蚊种的区分,弥补形态特征信息量不足等传统分类鉴定方法的缺点,为建立外来或新发现蚊种分子鉴定方法奠定基础。     

应用DNA条形码技术鉴定未知双翅目蛹

目的建立应用DNA条形码技术鉴定未知病媒种类的方法,尤其是非成虫态虫体或者肢体残缺个体的DNA条形码鉴定的方法和技术,以缩短鉴定周期。方法提取从英国进口废纸中截获的双翅目单只蛹基因组DNA,利用多细胞无脊椎动物线粒体细胞色素氧化酶I(COI)的通用引物进行DNA扩增。PCR产物直接从两端测序,测序引物同扩增引物,序列经拼接后得到清晰可读的709bp COI基因片段碱基序列。同时将截获的同批蛹的其他个体在实验室内孵化成成虫进行形态学鉴定,并抽提孵化的成虫的基因组DNA,扩增其COI基因片段,测序并与蛹的序列进行比较。与GenBank中的序列进行同源性比对,并用Clustal W2在线建立AD系统发育树。结果未知种类的蛹和Genbank中红头丽蝇Calliphora vicina的COI DNA序列(包括引物序列)99.4%相同。蛹化成虫形态鉴定为红头丽蝇,孵化后的成虫的DNA条形码数据与蛹的数据完全相符。结论根据结果可以判断所截获的未知种类的蛹为红头丽蝇Calliphora vicina。本文的研究证明了DNA条形码技术是一种快捷准确的种类鉴定方法,尤其是运用在非成虫态的种类鉴定上。     

DNA条形码技术在贵州茂兰鼠类鉴定中的应用

目的探讨基于线粒体COI基因的DNA条形码技术对鼠类进行准确的鉴定。方法以贵州茂兰地区的3个常见鼠种21个鼠类标本为研究对象,提取基因组DNA,扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因片段并测序,将测序结果进行BLAST比对,基于双参数模型计算鼠种种间和种内遗传距离,构建分子发育系统。结果 DNA条形码检测技术可用于该地区鼠种的鉴定,并能纠正现场形态学鉴定的失误。结论研究结果表明DNA条形码技术是一种有效可靠、易于操作的鼠类鉴定方法,能纠正形态学鉴定中的错误。     

河南口岸截获未知蝇种细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因分析

目的应用DNA条形码技术对河南口岸截获的1只形态不完整的未知蝇类进行鉴定。方法利用以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为目的基因的DNA条形码技术,对该未知蝇类基因组DNA进行扩增、序列比对和分析。结果通过DNA条形码鉴定和序列比对,该未知蝇类的DNA条形码序列与BOLD中绯颜裸金蝇的序列同源性高达100%,确认该蝇种为绯颜裸金蝇。结论 DNA条形码技术弥补了传统形态学鉴定的局限性,在国境口岸医学媒介生物鉴定中有广阔的应用前景。     

DNA条形码技术应用于口岸吸血蠓类快速分子鉴定的研究

目的建立口岸吸血蠓类快速分子鉴定方法,提高鉴定效率和准确率。方法选择口岸区域采集点,采集吸血蠓类。经形态学鉴定后,单只蠓提取基因组DNA,采用自行设计的COI基因扩增引物进行扩增。PCR产物经电泳鉴定后,进行双向测序。序列经分析后,去除引物序列和不稳定序列,进行拼接。提交至NCBI和BOLD数据库进行比对,并建立系统进化树进行验证。结果得到12个新序列,已登录至GenBank,登录号为KF528689~KF528700。其中台湾蠛蠓的COI序列(683 bp)填补了NCBI数据库的空白。所得序列经分析后可以将多种蠛蠓、库蠓很好地区分开。结论本项目所建立的基于吸血蠓类COI基因的DNA条形码快速分子鉴定方法可以很好地鉴定各吸血蠓种,值得进一步推广应用。     

DNA条形码识别Ⅲ．媒介蚊类DNA条形码芯片的初步研究

目的利用DNA条形码信息研制DNA芯片，建立快速高效的医学媒介蚊类鉴定方法。方法以蚊科5属15种，共30个样本为研究材料，获取其DNA条形码信息（CO I基因片段序列），采用基因块motif技术，搜索15个样本的同源保守基因序列，制作虚拟DNA条形码芯片。虚拟电子杂交30个样本，应用软件Bio-Edit计算属、种及种内个体间的同一性，应用phylip3．66软件以最大简约法分别对杂交结果和原序列进行聚类分析比较。结果选择78个DNA片段制作一张虚拟DNA条形码芯片，计算属间的平均同一性为0．75，同一属内种间的平均同一性为0．84，种内个体间的平均同一性为0．98，聚类分析结果一致。结论研制的虚拟DNA芯片能够鉴定本研究中的15种蚊虫，利用DNA条形码信息，设计DNA芯片在理论上可行。     

国境口岸常见11种蚊虫DNA条形码分子鉴定研究

目的通过研究国境口岸常见11种蚊虫的细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列差异性,并分析其系统进化关系,建立口岸常见蚊种的分子鉴定方法。方法设计l对扩增COI部分编码区的PCR引物,对广东、海南和云南等国境口岸采集的致倦库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊等常见11种成蚊进行PCR扩增和序列测定,依据COI核苷酸序列进行系统进化分析。结果 11种蚊虫的COI基因扩增片断长度均为650 bp左右,A+T含量为66.51%~69.97%。同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸序列同源性为94.8%~100.0%;不同蚊种间核苷酸序列同源性为77.7%~91.8%。系统进化关系显示,从种的水平上看,白纹伊蚊、致倦库蚊、中华按蚊等上述所有蚊种均聚集成簇,即同种之间呈明显的聚集,与形态学鉴定结果相一致。在属的水平上,库蚊属、阿蚊属、伊蚊属等均聚集成簇,形成各自的单独一支;各属间,阿蚊属与伊蚊属先聚类,再分别与库蚊属、曼蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊属与上述蚊种亲缘关系较远。结论本次研究中的COI基因差异可作为国境口岸常见11种蚊虫分类鉴定的分子标记,为口岸常见蚊种的分子鉴定提供帮助,也可为口岸外来的或新发现的蚊种的鉴别提供分子水平的技术依据。     

广东中山港监测到国内未见分布蚊种—波氏曼蚊

目的利用分子鉴定技术对在中山港捕获的1只未知蚊种进行鉴定。方法 2017年11月在中山港监测到1只未知蚊种(D88),形态鉴定为曼蚊属,结合COI和ITS2基因片段进行分子鉴定。结果捕获的蚊类D88的COI基因序列与波氏曼蚊(Mansonia bonneae)的遗传距离为0.0021,与常型曼蚊的遗传距离为0.0086;和波氏曼蚊的同源性为99.85%,和常型曼蚊(M. uniformis)的同源性为99.39%。ITS2基因序列和常型曼蚊的最小遗传距离为0.0333,最高同源性为仅96.48%;最终确定为波氏曼蚊。经过科技查新,确认为国内未见分布种。结论分子鉴定技术可在一定程度上纠正病媒生物形态鉴定的偏差。     

DNA条形码技术在河北省鼠疫疫源地鼠种鉴定中的应用

目的以河北省鼠疫疫源地常见鼠为对象,探讨DNA条形码技术在鼠类鉴定方面的可行性。方法2012年在河北省鼠疫疫源地内采集鼠肝脏标本,并保存整只鼠,制作剥制标本,提取基因组DNA,用通用引物PCR法扩增线粒体COⅠ基因,并测序。将测序结果与GenBank中其他鼠类物种的DNA条形码进行BLAST比对,并构建分子进化树。结果87份样本均能通过PCR扩增出特异性COⅠ基因条带,其中85份样本所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果一致,2份样本结果有差异,经反复鉴定头骨及形态标本,发现为现场鉴定错误。结论DNA条形码技术能够对鼠类进行有效的物种鉴定,同时还可以探讨啮齿动物属、种分类单元的系统发育问题。     

蚊体内马来丝虫幼虫的基因检测

目的：探讨蚊体内马来丝虫幼虫基因检测的新方法,并用于丝虫病监测。方法：利用基因工程技术合成马来丝虫寡核苷酸片段,经32P标记后作为探针,以斑点杂交法检测蚊体内马来丝虫幼虫。结果：该探针可从多种标本中特异地检出马来幼丝虫DNA,敏感性为2ng靶DNA量,蚊体内含1条幼虫即可出现阳性杂交。结论：该技术具有良好的实用性,可用于蚊体内马来丝虫幼虫的基因检测。     

广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法

[目的]建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系。[方法]设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系。[结果]5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp，A＋T含量为68．77％-70．6％。同源性比较表明，不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数，核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85．1％-93．7％和92．0％-99.3％。COI核苷酸系统进化关系显示，所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合，但骚扰阿蚊位于一单独的分支上，其亲缘关系与其它蚊种最远。COI基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致，库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科，中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系最远。[结论]建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分，后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

DNA条形码技术在未知昆虫幼虫种类鉴定中的应用

目的:建立用DNA条形码技术鉴定未知昆虫幼虫种类的方法,探讨DNA条形码在物种鉴定中的实用性。方法:利用多细胞无脊椎动物细胞色素氧化酶I(CO1)的通用引物进行PCR扩增,PCR产物克隆到pGM-T Vector中并测序,分别对同一种未知昆虫的成虫、幼虫的线粒体COI基因的709 bp片段进行序列分析,并与GenBank中的序列相比较。结果:测序结果未知种类的成虫和幼虫序列只有1个碱基的差异,一致性高达99.9%,与GenBank中的米象Sitophilus oryzae的序列一致性高达99.6%,与玉米象Sitophilus zeamais的序列一致性为86.6%。并与GenBank中其他种类的同一段序列相比较,用ClustalW-2构建系统关系树。以未知成虫的形态分类特征为验证,可以判断未知种类为米象。结论:结果表明运用DNA条形码技术能准确进行昆虫幼虫种类的鉴定。     

基于COⅠ基因的媒介蝇类快速分子鉴定研究

目的 为解决蝇类形态学鉴定的不足,建立基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的DNA条形码技术对蝇类进行分子鉴定。方法 选取烟台口岸常见的16只蝇类作为研究对象,形态学鉴定后,取蝇的单后足代表微量组织,提取总DNA。依据资料,选取COⅠ国际通用引物LCO1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′,HCO2198：5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′,建立PCR体系,完善PCR程序,有效扩增蝇类的COⅠ基因。纯化PCR产物后进行序列测定和比对。此外,应用Mega5.05软件分别用最大似然法、邻接法、最大简约法分析系统发育,构建系统发育树比较进化关系。结果 16只蝇类COⅠ基因扩增片段长度为690 bp,其中A＋T平均含量高达68.53%。序列比对结果及系统进化关系显示,16只蝇类COⅠ基因的分子鉴定与形态学鉴定结果一致。结论 应用DNA条形码技术可成功扩增蝇类的COⅠ基因,其分子鉴定与形态学鉴定结果完全一致,尤其适用于微量组织样本的鉴定。     

用DNA条形码技术鉴定阿拉善黄鼠和达乌尔黄鼠

目的 探索阿拉善黄鼠和达乌尔黄鼠的分类鉴定方法。方法 运用DNA条形码技术测定两地黄鼠的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因序列,分析遗传距离,构建系统发育NJ树。结果 11份阿拉善黄鼠的种内遗传距离〈2%,4份达乌尔黄鼠的种内遗传距离〈1%,两地黄鼠的遗传距离介于8%~9%之间,同时,NJ树将两地黄鼠分成2个独立分支。结论 阿拉善黄鼠为独立物种。DNA条形码技术可用于黄鼠种类鉴定。     

中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列比较

目的：比较中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列，从分子水平探讨不同地理株对登革病毒(DV)易感性的差异。方法：用聚合酶链反应从蚊虫基因组DNA扩增出COⅠ基因片段并进行克隆测序；用邻接法进行分子系统发育分析。结果：各地理株白纹伊蚊COⅠ基因片段序列长度均为415bp，所测各株序列均无缺失。云南思茅株的碱基转换率为1．93％，颠换率为0．24％。贵州麻尾株和广西南宁株的转换率为0．48％。各地理株中思茅株与麻尾株关系较近，麻尾株与南宁株关系较近，其余11个地理株均为同型株。结论：蚊虫对DV的易感性与多种因素有关，包括遗传及生态学方面(如季节气候、地理环境、人类活动等)的因素。在中国大多数白纹伊蚊为同型基因，其对DV的易感性尚无直接对应关系。     

DNA条形码在国境卫生检疫中的应用

综述了DAN条形码的发展历史、识别原理以及公共数据库,并讨论了DNA条形码在检验检疫领域的应用前景。DNA条形码与DNA芯片技术的结合,可在检验检疫领域中实现非专家鉴定。