MK2206对三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞增殖及耐药性的影响

摘 要：［目的］探讨Akt抑制剂MK2206对三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞株MDA-MB-231/DDP生长活性及耐药性的影响。［方法］ 使用不同浓度梯度的顺铂（DDP）、MK2206单药或联合作用于MDA-MB-231/DDP细胞,MTT法检测各药物对细胞的增殖抑制率;高效液相色谱法检测细胞内DDP药物浓度的改变;Western Blot、Real-time PCR分别检测细胞内Akt蛋白及MDR相关基因（MDR1、BCRP、MMP7、GST-π）的表达水平。［结果］ MK2206单药对MDA-MB-231/DDP细胞有明显的抑制作用,无毒剂量的MK2206可明显增强MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的敏感性,增加细胞内顺铂浓度,使细胞内Akt蛋白及MDR相关基因（MDR1、BCRP、MMP7、GST-π）的表达水平明显降低。［结论］ MDA-MB-231/DDP细胞的顺铂耐药性与细胞内Akt蛋白的过度表达有关,MK2206有明显的顺铂增敏作用,能部分逆转MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的耐药性,其机制可能与降低细胞内MDR1、BCRP、MMP7、GST-π的基因表达水平有关。     

GOLPH3沉默对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响

目的：探究 GOLPH3对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响。方法：不同浓度顺铂处理 A2780和 A2780／DDP 细胞72h,MTT 检测半数抑制浓度 IC50,Western blot 检测 GOLPH3的表达。将培养细胞分为4组：A2780组及 A2780／DDP 组（对照组、Scrambled siRNA 组、GOLPH3 siRNA 组）。40μmol／L顺铂处理48h 后,MTT 检测对细胞活性的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot 检测对Caspase －3、p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达的影响。Western blot 检测 mTOR 抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）和PI3K／Akt 抑制剂（LY294002）对 Caspase －3蛋白表达的影响。结果：顺铂处理72h 时,A2780和 A2780／DDP细胞的 IC50分别为9．8μmol／L 和60．14μmol／L。与 A2780组相比,A2780／DDP 组 GOLPH3蛋白表达明显增加（P ＜0．05）。GOLPH3 siRNA 转染可显著下调 A2780／DDP 细胞中 GOLPH3蛋白的表达（P ＜0．05）。顺铂处理后,与 A2780／DDP 对照组相比,A2780组和 A2780／DDP 细胞 GOLPH3 siRNA 转染组细胞活性显著降低,顺铂敏感性增加,细胞凋亡率和 Caspase －3蛋白表达上调,p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达下调;LY294002和 Ra-pamycin 处理均显著增加 Caspase －3蛋白表达（P ＜0．05）。结论：GOLPH3沉默可通过抑制 Akt／mTOR 激活促进顺铂诱导的 A2780／DDP 细胞凋亡。     

Wnt／β-catenin信号转导通路与肺腺癌顺铂耐药作用机制研究

目的：探讨Wnt／β-catenin信号转导通路在肺腺癌顺铂耐药中的分子作用机制。方法：体外常规培养人肺腺癌A549细胞和其顺铂耐药A549／DDP细胞,取对数生长期的细胞用于实验。采用MTT法检测A549和A549／DDP细胞对顺铂的IC50;采用AnnexinV／PI法和Hoechst33342染色法检测顺铂处理后2种细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测2种细胞中β-catenin和Survivin的表达;采用siRNA干扰沉默pcatenin的表达,检测A549／DDP细胞的Ic5。值、细胞凋亡率及β-catenin和Survivin的表达。结果：顺铂对A549／DDP细胞的IC50值为（28．984±1．404）μmol／L高于A549细胞的（5．888±0．338）umol／L,t=27．696,P〈0．001;20umol／L顺铂诱导A549／DDP细胞凋亡率为（21．75±0．96）％,显著低于A549细胞的（39．38±0．88）％,t=23．474,P〈0．001。A549／DDP细胞中β-catenin蛋白的表达为1．890±0．060,显著高于A549细胞的1．063±0．035,t=20．595,P〈0．001;在A549／DDP细胞中Survivin蛋白表达量为1．107士0．061,明显高于A549细胞的0．503±0．025,t=15．814,P〈0．001。RNAi技术沉默β-catenin蛋白耐药性（14．615±0．939）gmol／L,显著低于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（28．984±1．404）μmol／L,t=14．732,P〈0．001;RNAi技术沉默pcatenin蛋白细胞凋亡率为（37．57±0．64）％,显著高于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（21．75±0．96）％,t=23．699,P〈0．001;RNAi技术沉默伊catenin蛋白下游靶基因Survivin蛋白的表达为0．527±0．065,显著低于A549／DDP组的1．027±0．025和瞬时转染阴性对照siRNA组的1．033±0．040,F=116．944,P〈0．001。结论：抑制Wnt／β-catenin信号转导通路的活性可以降低A549／DDP细胞对顺铂的耐药性。     

乳腺癌耐药蛋白在乳腺癌组织中的表达及与预后关系

目的研究乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP）在乳腺癌组织中的表达,评估其在乳腺癌预后中的作用。方法采用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry,IHC）检测47例手术切除的乳腺癌组织中BCRP的表达,并分析其与临床、病理特征的关系及对预后的影响。结果（1）BCRP在乳腺癌组织中的阳性表达率为55．3％（26／47例）,其中高表达者13例（27．7％）;（2）激素受体阳性者BCRP表达水平明显高于激素受体阴性者（P〈0．05）,BCRP表达与月经状况、肿瘤大小、腋淋巴结转移和组织分级均无关（P〉0．05）;（3）Kaplan—Meier生存分析结果表明BCRP和无病生存期相关（P〈0．05）,但和总生存期无关（P〉0．05）;（4）Cox单因素分析显示肿瘤大小和BCRP表达与无病生存期明显相关（P〈0．05）,而肿瘤大小和总生存期也明显相关（P〈0．05）;在多因素分析中BCRP表达仅和无病生存期明显相关,此外腋淋巴结转移与无病生存期和总生存期均明显相关（P〈0．05）。结论BCRP在乳腺癌组织中具有较高的表达水平,但与乳腺癌患者预后无关。     

顺铂诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231/DDP细胞株的建立及鉴定

目的 建立人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂（DDP）耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法 采用逐步增加顺铂浓度、间歇诱导的方法,建立人三阴性乳腺癌MDA-MB-231/DDP体外耐药细胞模型;MTT法检测MDA-MB-231/DDP的耐药特性;高效液相色谱法检测耐药细胞内DDP药物浓度的改变; 实时荧光定量PCR法分析两种细胞耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及 GST-π表达差异。结果 MTT显示MDA-MB-231/DDP的顺铂、5-氟尿嘧啶及环磷酰胺的耐药指数分别为9.80、4.43及2.21;高效液相检测显示2种细胞分别与6 μg/ml的DDP接触24 h后,MDA-MB-231细胞内DDP的浓度为（47.10±2.37）ng/（5×10⁴） cells,而MDA-MB-231/DDP细胞则为（6.30±1.64）ng/（5×10⁴）cells（P<0.01）;MDA-MB-231/DDP细胞中MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因 mRNA的表达量分别是亲本细胞的15.39、13.73、22.52及44.90倍（P<0.01）。结论 逐步增加浓度、间歇诱导的方法建立了稳定、耐药性较高的MDA-MB-231/DDP细胞株,其耐药机制可能与ABC转运蛋白表达增加等多种机制相关。     

顺铂诱导耐药蛋白BCRP与EHD2表达上调并在细胞表面的富集

  目的  建立顺铂耐受的人肺腺癌A549/DDP细胞株,研究EHD2（EH domain-containing protein-2）与肿瘤细胞药物耐受的潜在关系。  方法  以DDP为诱导剂,采用低浓度逐步增量诱导方法建立人肺癌耐药细胞系A549/DDP,采用MTT法测定药物敏感性,免疫印迹法检测耐药蛋白BCRP及EHD2蛋白的表达水平,免疫荧光方法检测BCRP及EHD2的细胞定位。  结果  成功建立DDP耐药细胞系A549/DDP,对DDP的耐药指数为7.6;免疫印迹结果显示BCRP在耐药细胞系A549/DDP中的表达明显高于其亲本细胞A549,EHD2蛋白在耐药细胞系的表达略有增高;免疫荧光成像显示EHD2蛋白在细胞膜表面富集,并与BCRP耐药蛋白共定位。  结论  BCRP和EHD2在获得性耐药细胞中富集,并于细胞膜表面共定位,提示内吞蛋白EHD2可能调控耐药蛋白BCRP的膜稳定性,从而介导肿瘤细胞耐药。      

γ-干扰素联合顺铂通过调控xCT抑制三阴性乳腺癌转移的实验研究

摘 要：［目的］ 探讨γ-干扰素（interferon-gamma,IFN-γ）联合顺铂（cisplatin,DDP）抑制三阴性乳腺癌转移的机制。［方法］ 采用BALB/c小鼠构建三阴性乳腺癌模型,观察IFN-γ联合DDP的治疗效果。用流式细胞术检测细胞凋亡水平;CCK-8实验检测细胞增殖;实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测相关基因的表达;UALCAN 和 Kaplan-Meier Plotter 数据平台分析目的基因表达与乳腺癌预后的相关性;免疫组化检测肿瘤组织中目的蛋白的表达。［结果］ 各治疗组小鼠原位肿瘤体积均显著性缩小（P<0.05）,而IFN-γ与DDP联合治疗组小鼠肺转移灶数目显著减少（P<0.01）。 IFN-γ联合DDP促进小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1凋亡（P<0.001）,并显著性抑制肿瘤细胞增殖（P<0.001）。成纤维细胞L929上清能促进4T1细胞增殖（P<0.01）,且该作用被IFN-γ抑制（P<0.01）。谷胱甘肽促进4T1细胞增殖（P<0.001）,并且消除了IFN-γ对L929上清促肿瘤增殖的抑制作用（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,L929中胱氨酸/谷氨酸反转运体x（xCT） mRNA表达水平显著性下调（P<0.05）。数据库分析结果显示,乳腺癌患者的xCT 表达水平明显高于正常乳腺组织（P<0.001）,xCT高表达与较差的无远处转移生存期存在显著性相关（P<0.01）。免疫组化结果表明,发生肺转移的乳腺癌患者肿瘤组织中xCT表达水平显著性高于未发生肺转移者（P<0.001）。 ［结论］ IFN-γ联合DDP可能通过抑制L929 xCT的表达减少谷胱甘肽分泌,从而抑制三阴性乳腺癌转移。研究有望为三阴性乳腺癌转移的临床治疗提供新思路。     

MGMT的表达与乳腺癌化疗效果的预测

目的 探讨乳腺癌中MGMT蛋白的表达与烷化剂疗效的关系。方法 应用免疫组化法检测115例乳腺癌患者MGMT蛋白的表达，并结合分析其与环磷酰胺（CTX）、顺铂（DDP）、紫杉醇（PTX）或泰索帝（TXT）的疗效关系。结果 115例乳腺癌中MGMT蛋白总阳性率为86．1％（99／115）。MGMT蛋白阳性表达病例CTX，DDP的治疗有效率低，而MGMT蛋白低表达的病例CTX，DDP的治疗有效率高，MGMT高低与CTX，DDP的疗效显著相关（P〈0．01），但与紫杉类化疗药的疗效不相关（P〉0．5）。结论 检测乳腺癌中MGMT蛋白的表达水平可预测CTX及DDP的疗效，对实现乳腺癌的个体化化疗有参考意义。     

Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

顺铂耐药乳腺癌细胞株的建立及FANCF 基因在耐药中的作用

[摘要] 目的：探讨三阴性乳腺癌顺铂（cisplatin, DDP)耐药细胞和敏感细胞中FA/BRCA通路关键基因FANCF的表达和功能,以及与DDP耐药的相关性。方法：DDP浓度递增法诱导建立乳腺癌细胞MDA-MB-231的DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP;通过RNAi技术敲减MDA-MB-231 敏感细胞和DDP耐药细胞中FANCF,并在mRNA和蛋白水平进行敲减效果验证。CCK-8 法检测DDP耐药细胞株增殖活性,Western blotting 法检测该细胞中FANCF蛋白表达,流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞周期和凋亡情况,实时定量PCR（RT-qPCR）法检测FANCF mRNA的表达。结果：MDA-MB-231细胞DDP诱导3个月建立的MDA-MB-231/DDP细胞株耐药指数为13.5,其G0/G1 期细胞增多、S期和G2/M期细胞减少。MDA-MB-231/DDP细胞中FANCF mRNA和蛋白表达水平显著升高（均P<0.01）。FANCF敲低后MDA-MB-231/DDP细胞凋亡增加,细胞对DDP的药物敏感性显著升高（均P<0.01）。结论：FANCF基因通过抗凋亡作用导致MDA-MB-231细胞对DDP的耐药性,FANCF是乳腺癌治疗的一个潜在靶点。     

Akt抑制剂MK-2206在缺氧环境下对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响

目的:探讨Akt抑制剂MK-2206在缺氧环境下对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响。方法:根据CCK-8实验结果选择CoCl2和MK-2206的浓度,最后分成空白组、MK-2206组、CoCl2组、MK-2206+CoCl2组;Transwell小室实验检测四组细胞的迁移和侵袭能力;RT-PCR法检测各细胞组中Akt、mTOR、HIF-1α的mRNA表达水平;Western blot技术检测各细胞组中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、HIF-1α蛋白表达的差异性情况。结果:CoCl2诱导的缺氧环境可以促进SW480细胞的侵袭、迁移(P＜0.05),同时能够促进HIF-1α的mRNA和蛋白表达(P＜0.05),但是低浓度范围内的CoCl2对SW480细胞增殖活性无明显影响(P＞0.05);MK-2206可以在体外的常氧和缺氧环境中抑制SW480细胞的增殖活性和侵袭、迁移能力(P＜0.05);MK-2206能在体外的常氧环境下抑制SW480细胞的Akt、mTOR、HIF-1α的mRNA表达(P＜0.05),缺氧环境无明显作用;同时MK-2206能够在常氧和缺氧环境中显著降低p-Akt、p-mTOR、HIF-1α的蛋白表达水平(P＜0.05)。 结论:Akt抑制剂MK-2206可以在体外的常氧和缺氧环境下抑制SW480细胞的增殖活性和侵袭能力,但缺氧环境可能会弱化MK-2206对SW480细胞迁移的抑制作用。     

ER和MDM2及ERK1/2信号通与卵巢癌耐药关系的研究

目的:探讨ER、MDM2和ERK1/2信号通路在卵巢癌中的相关性及与卵巢癌耐药的关系。方法:采用免疫组织化学SP法检测40例卵巢癌标本中ER、MDM2及P-糖蛋白(P-gp)的表达水平;采用MTT比色分析法检测该40例标本对紫杉醇(PTX)、表柔比星(EADM)、顺铂(DDP)和卡铂(CBP)的药物敏感性;通过酶活性测定,检测ERK1/2酶活性。结果:PTX和EADM耐药者ERK1/2酶活性分别增高1.5倍,P值分别为0.015和0.004;ERK1/2酶活性与PTX和EADM的抑制率负相关,r分别为-0.531和-0.488,P<0.01;ER和MDM2不同表达水平间ERK1/2酶活性差异均有统计学意义,P值分别为0.001和0.034;P-gp阳性组ERK1/2酶活性是阴性组的1.4倍,P=0.022;P-gp阴性组PTX和EADM的抑制率分别是阳性组的1.5和2.0倍,P值分别为0.021和0.004;P-gp与MDM2的表达正相关,r=0.396,P<0.05;MDM2不同表达水平,PTX和EADM抑制率的差异有统计学意义,P值分别为0.024和0.039;ER与MDM2的表达正相关,r=0.671,P<0.01;DDP和CBP在本实验中差异无统计学意义。结论:ER、MDM2及ERK1/2激酶活性之间存在正相关性;ERK1/2激酶活性和MDM2的表达均与P-gp的表达正相关;卵巢癌PTX和EADM耐药的产生与ERK1/2酶活性的升高和P-gp及MDM2表达的增强有关。     

左旋棉酚对小鼠宫颈癌移植瘤细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨左旋棉酚［(-)-gossypol,LGP］对顺铂诱导小鼠宫颈癌移植瘤凋亡的影响及可能的作用机制。方法建立小鼠宫颈癌U14细胞皮下移植瘤模型,将60只小鼠按随机原则分为左旋棉酚组、顺铂(Cisplatin,DDP)组、左旋棉酚+顺铂(LGP+DDP)组及模型对照（Model Control）组4组,用药干预8天后采用电子天平称量瘤重并计算抑瘤率;采用TUNEL法检测各组瘤组织的凋亡情况;采用免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax和P-gp蛋白的表达水平。结果各干预组小鼠移植瘤瘤重均低于Model组,其中LGP+DDP组瘤重最低,其次为DDP组(P＜0.01);各组移植瘤组织内AI均高于Model组（P＜0.05）,且LGP+DDP组最高（P＜0.01）;含LGP组移植瘤组织内P-gp、Bcl-2蛋白的表达降低（P＜0.05）, Bax蛋白的表达升高（P＜0.05）,Bax/Bcl-2比值升高,LGP+DDP组的上述作用明显优于单药组（P＜0.01）;相关性分析表明P-gp蛋白的表达量与Bcl-2的表达量呈正相关,与Bax的表达量呈负相关（P＜0.01）。结论 LGP能抑制小鼠宫颈癌移植瘤的生长,且与DDP联合后抑制作用更显著;其可能的机制:LGP可能是通过下调Bcl-2、上调Bax蛋白诱导小鼠宫颈癌细胞凋亡,降低P-gp蛋白的表达,增加肿瘤组织对DDP的化疗敏感度。     

The AKT Inhibitor MK-2206 is Cytotoxic in Hepatocarcinoma Cells Displaying Hyperphosphorylated AKT-1 and Synergizes with Conventional Chemotherapy

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common potentially lethal human malignancies worldwide. Advanced or recurrent HCC is frequently resistant to conventional chemotherapeutic agents and radiation. Therefore, targeted agents with tolerable toxicity are mandatory to improve HCC therapy and prognosis. In this neoplasia, the PI3K/Akt signaling network has been frequently shown to be aberrantly up-regulated. To evaluate whether Akt could represent a target for treatment of HCC, we studied the effects of the allosteric Akt inhibitor, MK-2206, on a panel of HCC cell lines characterized by different levels of Akt-1 activation. The inhibitor decreased cell viability and induced cell cycle arrest in the G₀/G₁ phase of the cell cycle, with a higher efficacy in cells with hyperphosphorylated Akt-1. Moreover, MK-2206 induced apoptosis, as documented by Annexin V labeling, and also caused autophagy, as evidenced by increased levels of the autophagy marker LC3A/B. Autophagy was shown to be a protective mechanism against MK-2206 cytotoxicity. MK-2206 down-regulated, in a concentration-dependent manner, the phosphorylation levels of Akt-1 synergizedand its downstream targets, GSK3 α/β and FOXO3A. MK-2206 synergized with doxorubicin, a chemotherapeutic drug widely used for HCC treatment. Our findings suggest that the use of Akt inhibitors, either alone or in combination with doxorubicin, may be considered as an attractive therapeutic regimen for the treatment of HCC.     

柚皮苷逆转人卵巢癌耐药SKOV3／DDP细胞耐药性及逆转机制的研究

目的 研究柚皮苷对卵巢癌顺铂（DDP）耐药细胞SKOV3／DDP体外增殖的影响及耐药逆转作用,并初步探讨相关耐药机制。方法采用MTT法测定DDP对SKOV3和SKOV3／DDP细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）,柚皮苷对SKOV3／DDP细胞的增殖抑制作用及柚皮苷联合DDP对SKOV3／DDP细胞的增殖抑制作用。筛选出非细胞毒性的柚皮苷浓度,将实验细胞分为空白对照组、2.5 μg／ml DDP组、10 μmol/L柚皮苷组、10 μmol/L柚皮苷联合2.5 μg／ml DDP组,分别采用RT-PCR和Western blotting测定各组作用48 h后耐药基因MDR1 mRNA及MRP2 mRNA的表达及其相应的表达产物P-gp、MRP2蛋白的表达水平。结果1～32 μg／ml DDP处理SKOV3及SKOV3／DDP细胞48 h后,SKOV3细胞的IC₅₀为5.48 μg／ml,SKOV3／DDP细胞为14.93 μg／ml,耐药指数为2.72。柚皮苷对SKOV3／DDP细胞有明显的增殖抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。选取10 μmol／L柚皮苷作为逆转耐药实验浓度,10 μmol／L柚皮苷联合DDP作用48 h后,SKOV3／DDP细胞对DDP的耐药指数为1.62,逆转倍数为1.68。RT-PCR及Western blotting检测显示,柚皮苷联合DDP组与DDP单药组比较,MDR1 mRNA、MRP2 mRNA表达及P-gp、MRP2蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论柚皮苷对卵巢癌SKOV3／DDP细胞的体外增殖具有明显抑制作用,并能逆转SKOV3／DDP细胞的耐药性,其逆转耐药的机制可能与下调耐药基因MDR1 mRNA及MRP2 mRNA及相应的P-pg、MRP2蛋白的表达有关。     

榄香烯乳剂对肺癌A549/DDP细胞株耐药逆转作用及其机制

目的:探讨榄香烯乳（elemene,ELE）逆转人肺腺癌A549/DDP细胞株耐药性及其机制。方法:采用MTT法检测榄香烯乳单用的细胞毒作用及与顺铂（cisplatin,DDP）合用时耐药逆转作用;采用流式细胞术检测榄香烯乳对A549/DDP细胞内罗丹明-123（rhodamine-123,Rh123）蓄积的影响;采用Western blot检测榄香烯乳对耐药细胞A549/DDP细胞膜上P-gp蛋白表达的影响。结果:不同浓度榄香烯对A549/DDP细胞均有一定的抑制作用,呈时间-剂量依赖性效应。单用DDP的IC50为15.46μg/ml,合用20μg/ml榄香烯24h,IC50为4.15μg/ml,逆转耐药倍数为3.63。同时,榄香烯增加A549/DDP细胞内Rh123的蓄集,降低细胞膜上P-gp的表达,且呈剂量依赖性,表明榄香烯能减少A549/DDP细胞对药物的外排和抑制P-gp蛋白的表达。结论:榄香烯在体外逆转肿瘤细胞耐药性可能与其抑制P-gp的功能和表达有关。     

Reversion of multidrug resistance by SKI-II in SGC7901/DDP cells and exploration of underlying mechanisms

In order to investigate whether SKI-II could reverse drug resistance and its possible mechanisms, we treated SGC7901/DDP cells with SKI-II or SKI-II in combination with DDP. Then cell growth, apoptosis, micro- morphological changes, and expression of SphK1, P-gp, NF-kB, Bcl-2 and Bax were assessed by MTT assay, flow cytometry, electron microscopy, immunocytochemistry and Western blot assay respectively. SGC7901/DDP cells were insensitive to cisplatin 2.5 mg/L, but when pretreated with SKI-II, their proliferation was inhibited by cisplatin 2.5mg/L significantly, the inhibition rate increasing with time and dose. The apoptosis rate was also significantly elevated. Expression of SphK1 and P-gp was decreased significantly, Pearson correlation analysis showing significant correlation between the two (r=0.595, P<0.01). Expression of NF-kB and Bcl-2 was decreased significantly, while that of Bax was increased, compared to the control group. There were significant correlations between SphK1 and NF-kB(r=0.723, P<0.01), and NF-kB and Bcl-2(r=0.768, P<0.01). All these data indicated that SKI-II could reverse drug resistance of SGC7901/DDP to cisplatin by down-regulating expression of P-gp and up-regulating apoptosis through down-regulation of SphK1. The increased apoptotic sensitivity of SGC7901/ DDP to cisplatin was due to the decreasing proportion of Bcl-2/Bax via down-regulating NF-kB.     

MK-2206, an Akt inhibitor,enhances carboplatinum/paclitaxel efficacy in gastric cancer cell lines

Background Several molecularly-targeted agents are being evaluated in gastric cancer cell lines. In this study we evaluated the synergistic potential of MK-2206, an oral potent allosteric Akt inhibitor, in combination with chemotherapeutic agents in human gastric cancer cell lines. Materials and Methods We evaluated effects of MK-2206 on cell growth and cell signaling using a panel of gastric cancer cell lines AGS, SNU-1 and SNU 16. The analysis of drug combinations was conducted by using CellTiter-Blue™ Cell Viability Assay which yielded the combination index (CI). MK-2206 and representative chemotherapy agent were further evaluated regarding their effects on Akt inhibition and downstream targets using western blots probed with the appropriate antibodies. We assessed the combination of MK-2206 and chemotherapy in three different treatment sequences. Results We demonstrated in vitro synergistic efficacy of MK-2206 when combined with carboplatinum and paclitaxel in the three cell lines examined. Efficacy was dose dependent. We assessed the combination of MK-2206 and carboplatinum/paclitaxel in three different treatment sequences; 24 h of exposure to combination chemotherapy followed by a 48 h exposure to MK-2206 resulted in the highest synergistic antiproliferative effect in all cell lines. On the other hand, the reverse sequence (MK-2206 followed by chemotherapy) and the concurrent treatment schedule were slightly synergistic or additive as well. The effects of MK-2206 on p-Akt and other downstream targets was reported. Conclusions Our findings suggest that Akt inhibition augments the efficacy of existing gastric cancer therapeutics (carboplatinum and paclitaxel); thus, MK-2206 is a promising agent to treat gastric cancer patients who receive these cytotoxic agents. The magnitude of synergy depended on the treatment sequence; a schedule of MK-2206 dosed before or concurrently with chemotherapy was not as effective as being dosed after chemotherapy. Further experiments addressing MK-2206’s mechanism of action in combination with chemotherapy are needed.